シングルセル遺伝子発現解析/エピゲノム解析による骨巨細胞腫の発生・進展過程の解明

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K16648
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 津田 祐輔 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (70896018)
• 研究期間 (年度): 2021-04-01 – 2024-03-31
• キーワード: シングルセル解析 / 軟部明細胞肉腫 / 腫瘍免疫

研究実績の概要

明細胞肉腫の原発巣、リンパ節のそれぞれ1検体から組織を採取し、1細胞ごとにdropletに分離し、Reagent Kits v3（10x genomics社）を用いてライブラリ調整した。Hiseq 2500にてシークエンスし、Cell Ranger 6.0を用いて、細胞ごとの遺伝子発現情報を取得した。R 4.0.2, Seurat 4.0を用い、feature RNA 500以上,ミトコンドリア遺伝子占有率15%以下の質の低い細胞のデータを除外した。リガンド-受容体解析にはnichenetrを用いた。
原発巣では4631細胞、リンパ節転移部では2322細胞を解析対象とした。2検体を統合し解析を行い、10個のclusterに分けアノテーションを行ったところ、Tumor、T cell、NK cell、Macrophage/Monocyte、Endothelial cell、Fibroblast、B cellが同定された。腫瘍内免疫環境の解析を行うと、特にリンパ節内のCD4+細胞やCD8+細胞は、BATF+ FOXP3+ CTLA4+ CD4+ T cell (Regulatory T cell, Treg)やLAG3+ PD1+ CD8+ T cell(Exhausted T cell)が多く、免疫抑制的な腫瘍環境を形成していた。T regはTGFβ1やCXCL12によって分化誘導されることが知られており、リガンド-受容体解析においてMacrophageやEndothelial cellのTGFβ1リガンドとT細胞におけるTGFβ1受容体、FibroblastのCXCL12リガンドとT細胞のCXCR4受容体との結合が示唆された。
シングルセル解析によって、軟部明細胞肉腫内の細胞集団不均一性が明らかになり、免疫抑制的な環境が構築されていることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

コロナウイルス感染症の蔓延により検体収集に遅れが生じた。

今後の研究の推進方策

検体数を増やし、シングルセル解析を行い、同様の所見が得られるかどうかを検討する。これらの検討から得られた結果をもとにして、遺伝子発現/エピゲノム異常をターゲットとした新規治療の可能性を探索する。新鮮腫瘍組織より樹立されたcell lineを使用して、治療標的となる遺伝子に関して遺伝子過剰発現・抑制実験により、増殖能をATP assayなどで測定し、コントロールの細胞株との比較を行う。また、足場非依存性増殖能を評価するためColony formationassay を行う。浸潤能を基底膜モデルキット、また、遊走能をScratch assayなどにより評価を行う。上記の結果より有望な治療標的が同定された場合には腫瘍細胞に対して薬剤を添加し評価を行う。ゼノグラフトモデルを作成して薬剤を投与し、腫瘍形成抑制効果を確認する。これらの結果をまとめて学会発表、論文作成を行う。

次年度使用額が生じた理由

追加検体のシングルセル解析、同定された遺伝子変異の機能解析、学会発表、論文作成/公表に必要な資金を要する見込みである。追加検体のシングルセル解析（600000円）、同定された遺伝子変異の機能解析（100000円）、学会発表、論文作成/公表（50947円）を使用する計画である。

研究成果

• [雑誌論文] Generating in vitro models of NTRK-fusion mesenchymal neoplasia as tools for investigating kinase oncogenic activation and response to targeted therapy. (2023)
  • 著者名/発表者名: Vanoli F, Herviou L, Tsuda Y, Sung P, Xie Z, Fishinevich E, Min SS, Mallen W, de Wardin HT, Zhang Y, Jasin M, Antonescu CR.
  • 雑誌名: Oncogenesis. 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1038/s41389-023-00454-6.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Role of perioperative chemotherapy and radiotherapy for localized high-grade malignant peripheral nerve sheath tumor at the extremities and trunk wall: a population-based cohort study (2023)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi H, Zhang L, Okajima K, Hirai T, Tsuda Y, Ikegami M, Kawai A, Tanaka S.
  • 雑誌名: Jpn J Clin Oncol. 巻: 53 ページ: 138-145
  • DOI: 10.1093/jjco/hyac178.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] CORR Insights: What Proportion of Patients With Musculoskeletal Tumors Demonstrate Thromboelastographic Markers of Hypercoagulability? A Pilot Study (2023)
  • 著者名/発表者名: Yusuke Tsuda
  • 雑誌名: Clin Orthop Relat Res. 巻: 481 ページ: 562-563
  • DOI: 10.1097/CORR.0000000000002372.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Dramatic response to entrectinib in a patient with malignant peripheral nerve sheath tumor harboring novel SNRNP70-NTRK3 fusion gene (2023)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi H, Makise N, Shinozaki-Ushiku A, Zhang L, Ishibashi Y, Ikegami M, Tsuda Y, Kohsaka S, Ushiku T, Oda K, Miyagawa K, Aburatani H, Mano H, Tanaka S.
  • 雑誌名: Genes Chromosomes Cancer. 巻: 62 ページ: 47-51
  • DOI: 10.1002/gcc.23089. Epub 2022 Aug 18.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Clinical analysis of multimodal treatment for localized synovial sarcoma: A multicenter retrospective study (2023)
  • 著者名/発表者名: Hagiwara Y, Iwata S, Ogura K, Kawai A, Susa M, Morioka H, Hiruma T, Tsuda Y, Kawano H, Yonemoto T, Ishii T, Okazaki K.
  • 雑誌名: J Orthop Sci. 巻: 28 ページ: 261-266
  • DOI: 10.1016/j.jos.2021.09.012. Epub 2021 Oct 27.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Atypical Neurofibromatous Neoplasm with Uncertain Biologic Potential in the Posterior Mediastinum of a Young Patient with Neurofibromatosis Type 1: A Case Report (2022)
  • 著者名/発表者名: Miyamoto K, Kobayashi H, Zhang L, Tsuda Y, Makise N, Yasunaga Y, Ikemura M, Nakai Y, Shibata E, Ushiku T, Tanaka S.
  • 雑誌名: Case Rep Oncol . 巻: 15 ページ: 988-994
  • DOI: 10.1159/000526844. eCollection 2022 Sep-Dec.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Preoperative arterial embolization and wound complications after resection of malignant bone tumor in the pelvis: a nationwide database study (2022)
  • 著者名/発表者名: Zhang L, Michihata N, Matsui H, Fushimi K, Yasunaga H, Tsuda Y, Tanaka S, Kobayashi H.
  • 雑誌名: Jpn J Clin Oncol. 巻: 52 ページ: 1176-1182
  • DOI: 10.1093/jjco/hyac100.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Kobayashi H, Zhang L, Hirai T, Tsuda Y, Ikegami M, Tanaka S. (2022)
  • 著者名/発表者名: Clinical characteristics of undifferentiated pleomorphic sarcoma of bone and the impact of adjuvant chemotherapy on the affected patients: a population-based cohort study
  • 雑誌名: Jpn J Clin Oncol. 巻: 52 ページ: 589-598
  • DOI: 10.1093/jjco/hyac017.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Role of adjuvant chemotherapy in patients with localized, undifferentiated pleomorphic sarcoma of soft tissue: a population-based cohort study (2022)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi H, Zhang L, Hirai T, Tsuda Y, Ikegami M, Tanaka S.
  • 雑誌名: Int J Clin Oncol. 巻: 27 ページ: 802-810
  • DOI: 10.1007/s10147-021-02102-8.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impact of the national sarcoma guidelines on the prevalence and outcome of inadvertent excisions of soft tissue sarcomas: An observational study from a UK tertiary referral centre (2022)
  • 著者名/発表者名: Fujiwara T, Evans S, Stevenson J, Tsuda Y, Gregory J, Grimer R, Abudu A.
  • 雑誌名: Eur J Surg Oncol. 巻: 48 ページ: 533-540
  • DOI: 10.1016/j.ejso.2021.11.013. Epub 2021 Nov 14.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Comparison of clinical features and outcomes of patients with leiomyosarcoma of bone and soft tissue: a population-based cohort study (2022)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi H, Zhang L, Hirai T, Tsuda Y, Ikegami M, Tanaka S.
  • 雑誌名: Jpn J Clin Oncol. 巻: 52 ページ: 143-150
  • DOI: 10.1093/jjco/hyab176.
  • 査読あり
• [学会発表] シングルセルRNAシークエンスによる軟部明細胞肉腫の腫瘍内免疫環境の解析 (2022)
  • 著者名/発表者名: 津田祐輔
  • 学会等名: 第55回日本整形外科学会骨軟部腫瘍学術集会