研究課題
正常妊娠初期(n=2),正常妊娠後期(n=1)、妊娠高血圧腎症（PE)(n=1)から取得した子宮内膜リンパ球、正常妊娠後期(n=1)から取得した末梢血リンパ球を、それぞれの症例で異なるDNAハッシュタグを付加し識別可能とした。CD4陽性細胞(Tconv)をセルソーターで分離し、BD Rhapsody single cell analysis systemで単一細胞からcDNAテンプレート作成を行った。その後次世代シークエンサーによるsequencing、データ解析(単一細胞mRNA＋T細胞受容体(TCR))を施行した。発現変動のある遺伝子をもとに、クラスタリング解析を施行したところ、CD4陽性細胞は10種類のTconvクラスター（ナイーブ、活性化、PD-1陽性抑制型）と、FoxP3+制御性T細胞(Treg)の計11のクラスターから成るヘテロな集団であることが判明した。PD-1陽性抑制型、活性化Tconv、TregクラスターではTCRのクローナリティが高く抗原刺激を受け分化した集団であることが示唆された。細胞分化解析とTCR解析の組み合わせから、CD4+Tconvはナイーブ型から活性化TconvあるいはPD-1+抑制型へ分化していることが示唆された。これは、EVTとCD4+Tconvの直接接触によりPD-1+抑制型T細胞が誘導され、その機序にEVTのHLA-CとTconvのTCRの相互作用が関与していることを示した既報(Salvany-Celades et al.,2019.)と一致する。一方、正常妊娠例では、Treg分画で増加しているクローンは他の分画とほぼ重複せず、Tconvとは異なる抗原を認識していると考えられた。興味深いことに、PEではTregの一部がマスター遺伝子FoxP3発現を失い活性化Tconvへ分化しており、系列的安定性が損なわれていることが示唆された
2: おおむね順調に進展している
Ⅰ. 正常妊娠とPE症例で、抗原特異的Tregの機能分子発現を比較検討し、免疫学的治療の標的となる病態関連分子を明らかにする。（2021-2022年度）Ⅱ. 妊娠子宮で機能する抗原特異的Tregの誘導過程を明らかにする。（2021-2022年度）上記を明らかにするための、単一細胞mRNA+TCR解析は、正常妊娠初期(n=2),正常妊娠後期(n=1)、妊娠高血圧腎症（PE)(n=1)で既に終了している。正常妊娠初期(n=2)、正常妊娠後期(n=2)、PE(n=2)を追加取得し、現在次世代シークエンサーでのsequence中である。追加サンプルを加えて再度データ解析を2022年度中に行う予定である。
Ⅲ. 末梢血TregのTCRレパートリーならびにmRNA発現解析から、PE発症時の子宮内免疫環境を反映する因子を同定する。この課題を2022-2023年度で行う予定である。子宮内のCD4陽性細胞は、子宮所属リンパ節から誘導された集団、あるいは組織特異的な集団で、末梢血に反映されない可能性もある。そこで、末梢血CD4陽性細胞、子宮内膜CD4陽性細胞を、一人の患者から取得したサンプルを、単一細胞mRNA解析＋TCR解析のためシークエンスしたデータがあるため、このデータを用い、末梢血と子宮内膜でクラスター・TCRに重複があるかを確認する。両者間で重複あるいは類似性があるクラスターをソーティングし、bulkでのTCR解析に供することを考えている。
2022年2月に施行したsingle-cell mRNA + TCR sequenceのサンプルを受託解析に提出したが、納期の関係上、ライブラリー合成までを今年度、シーケンス・解析を次年度の請求としたため、残余が発生した。この分は次年度の請求となったシーケンス・解析に使用する。
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