| 研究課題/領域番号 |
21K16800
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| 研究機関 | 東京医科大学 |
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研究代表者 |
山本 阿紀子 東京医科大学, 医学部, 講師 (50531224)
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| 研究期間 (年度) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | CRISPR / 卵巣癌 / プロモーター解析 / MYC |
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| 研究実績の概要 |
卵巣癌細胞株であるOVSAHOにMYCのプロモーター領域と八放サンゴDendraに由来する蛍光タンパクを組み込んだベクターを導入し、MYCのプロモーター領域を発現するOVSAHO細胞を樹立した。この細胞はMYCが過剰発現すれば光照射により蛍光を発するように設計されている。この細胞に対してCRISPRLibraryを導入することにより、MYCが過剰発現していると予想される細胞をDendraの発光を用いてソーティングし、回収した。予備実験で用いたHEK細胞はsingle cellで回収し、十分解析に耐えられたが、しかし、OVSAHOはクローニングが難しく、回収方法を変更しながら、解析できる細胞数までクローニングできる方法を模索した。ソーティングゲートを変更しながら、うまく回収できた細胞から抽出したDNAを用いて、組み込まれたgRNAの配列をサンガーシーケンスを用いて解析すると、いずれもMYCそのものであることが判明した。そこで、OVSAHOに導入するベクターのMYCのgRNAの配列に変異を加え、同様の実験を行ったが、それでもシーケンスの結果はMYCであった。改善策としてMYCのgRNAの配列部位を完全に欠失させたベクターを作成し、OVSAHOに導入した。この細胞を用いてプロモーターアッセイを行うと、MYCgRNAをインフェクションさせてもプロモーター活性が上昇しないことを確認した。そこで、この細胞に対してCRISPRLibraryを導入し、再度ソーティングを行い、細胞を回収した。回収した細胞の一部を用いて、gRNA領域のTOPOクローニングを行った後に、サンガーシーケンスにて導入されたｇRNAを確認したところ、複数個の分子が同定し得た。そのため、このサンプルに対して次世代シーケンスを行い、MYCの活性を挙げる分子の同定を予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初、回収した細胞にたいして導入されたと判断されるｇRNAが複数種類確認できればただちに次世代シーケンスに提出する予定としていた。しかし、回収した細胞から検出されたのはMYCのみであることが、条件を変更しても続いたため、MYC以外の分子が検出される方法を樹立するのに予定以上の時間を要した。
また、研究者が2022年7月より3か月間、海外での医療活動に従事していたためその間の研究が滞ったことも進捗が遅れる原因となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在次世代シーケンスの結果待ちである。結果の解析をし、候補となる遺伝子が同定されれば、その分子を用いて、検証実験を進めていく。具体的にはOVSAHOに対して、これらの分子を過剰発現させたときのMYCのmRNAやタンパクレベルでの発現を検証することや、実際の臨床検体を用いて、タンパクの発現の確認や、予後との相関を解析する予定である。またその分子を阻害することによる抗腫瘍効果を細胞実験で行い、うまく、抗腫瘍効果を確認できれば動物を用いた生体内での反応を確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次世代シーケンスに提出するのが遅れたため、必要経費が予定より少なかった。結果が返れば検査の費用と、検証実験のために必要な試薬などを購入する予定である。
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