2021 年度実施状況報告書

脂肪幹細胞における細胞外カルシウムによる骨形成

研究課題

研究課題/領域番号	21K17022
研究機関	九州大学
研究代表者	矢内理沙 (糸永理沙) 九州大学, 歯学研究院, 共同研究員 (60755271)
研究期間 (年度)	2021-04-01 – 2024-03-31
キーワード	脂肪幹細胞 / BMP-2 / Ca
研究実績の概要	顎顔面骨の欠損の再建には高度で繊細な技術を必要とする。現在主流となっている治療法は金属プレートあるいは自家骨を用いた再建であるが、感染の面や侵襲が大きいことなど問題点も多い。このため脂肪由来間葉系幹細胞(ASCs)を用いたより良い再建方法を確立したいと考え研究を行った。私たちはこれまでにヒトASCs(hASCs)の骨形成分化におけるBMP-2の影響について検討を行い、BMP-2によって骨分化が促進させるという結果を得ている。ただ、リコンビナントBMP-2はコスト面や安全性の面で臨床応用は限定的である。そのためBMP-2によらない細胞外Caイオンのみを利用するhASCsの骨再生の可能性を探ってきた。その結果、細胞外Caイオン濃度を上昇させることにより、hASCsに自らBMP-2を分泌させ、autocrine / paracrine 的に自ら骨形成分化を誘導活性化する可能性が示唆された。また、その細胞内シグナル伝達機構にはCa / CaM / NFAT経路の関与が示された。このことから、実際にin vivoでのCaイオン刺激を加えたhASCsの骨分化再生能を解析することで、臨床応用可能であるか明らかにすることとした。まずはヌードマウスの皮下に立体構造の骨を作ることを目的とした。足場はポリ乳酸(PGA)を使用した。hASCsを立体構造のPAGと共に通常の培地で培養すると３日目には細胞の付着が確認できた。培養７日目に高濃度Caイオンを含む骨分化誘導培地に替えると、hASCsは骨へ分化し始めた。このままさらに骨分化誘導培地で７日間培養したのち、PGAをヌードマウスの皮下に移植した。皮下でさらに成熟した骨への分化を期待している。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由本研究の最終目標は、Caイオン誘導性hASCsの骨形成を確立し、より安全に効果的にかつ安価に骨を再生させることにある。私たちはこれまでに、Caイオン刺激によりhASCs自らBMP-2を産生するうえでのシグナル伝達に関与が示唆される因子やhASCsの骨形成分化を誘導活性化する経路を検索してきた。その結果を踏まえ、in vivoにおいてCaイオン刺激を加えたhASCsの実際の骨分化再生能を解析することで、臨床応用可能であるか明らかにすることを目的とした。そのための最初の目標として、ヌードマウスの皮下にPGAを足場としたhASCsの立体構造を移植し骨形成を確認することとした。臨床応用する際には欠損している骨と同じ形態のPAGを用いたい考えていたため、様々な形態のPAGで細胞付着するか検討した。また付着する細胞数をどのくらいにするかを踏まえて通常培地での培養期間を振り分けて研究した。骨分化誘導培地への交換のタイミングや期間も変えながら試した上で、最適ではないかと思われる方法が導かれた。皮下への移植も上達し骨が形成されつつあることまで確認できている。このためおおむね順調に研究できていると考えている。
今後の研究の推進方策	in vivoにおいてCaイオン刺激を加えたhASCsの実際の骨分化再生能を解析するための次の目標として、顎裂モデルの骨欠損部に骨を形成することが挙げられる。そのためにはまず顎裂モデルマウスの作成が必要となる。A/WySnマウスは口唇裂、唇顎口蓋裂の自然発症が高いことが知られていることから、これらのマウスより顎裂モデルマウスを作製することを考えている。顎裂を有したマウスの印象採得を行い、裂の形態を模型で再現する。模型より裂の形態に合わせたPGAを作成し、PGAにhASCsを付着させ顎裂部に移植し皮下ではなく裂部にその形態に合った骨が形成されるか検討する。この方法による骨形成が確立できれば、将来的には骨欠損患者のCTより３Dプリンタを用いてその顎骨モデルを作成し、欠損に合わせたPGAに患者の皮下より採取したhASCsを付着させ移植するだけで骨の形成・再建が可能となる。臨床応用が可能となれば健全部位からの骨採取が必要なくなり患者の負担は大幅に軽減されると考える。
次年度使用額が生じた理由	今年度の研究では、in vivo研究とはいえマウスを用いる実験は少なく、in vitroで試行錯誤する期間が多かった。このため、すでに持っている試薬や機器で賄うことができ新たな購入は少なかった。今後は使用するマウスの個体数も増加することが見込まれ、また顎裂マウスの作成や購入を検討している。次年度は当初見込まれた使用額より増えることが考えられる。