| 研究課題/領域番号 |
21K18194
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
新宅 博文 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 理研白眉研究チームリーダー (80448050)
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| 研究分担者 |
口丸 高弘 自治医科大学, 医学部, 准教授 (10570591)
錦井 秀和 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (30512834)
塩見 晃史 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 基礎科学特別研究員 (60880557) [辞退]
金子 泰洸ポール 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 特別研究員 (80873504) [辞退]
鳥井 孝太郎 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 特別研究員 (80878463) [辞退]
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| キーワード | 1細胞 / 電気泳動 / マイクロ流体工学 / RNA-sequencing / 造血幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
ナノスケールの内径を有するキャピラリを用いたナノエレクトロポレーションによる非殺傷的なRNA抽出法について、HeLa細胞を用いて電圧条件を検討し、2.5時間おきに4回程度、すなわち7.5時間、断続的にRNAを抽出することに成功した。また、その条件下で細胞周期進行に影響が出ないことを蛍光プローブFucci (SA)を用いて確認した。抽出したRNAから次世代シーケンス用のRNA-seqライブラリを作製し、データを取得した。得られたデータを解析したところ、細胞周期進行に応じた遺伝子発現変動を確認することができた。また、時系列の細胞の蛍光写真から得られた細胞周期進行と遺伝子発現変動の統合解析から、細胞周期進行速度に観察されたゆらぎを説明し得る遺伝子制御ネットワークの部分グラフを抽出することに成功した。次に開発したRNA抽出法を線虫の受精卵に適用し、１細胞期、２細胞期および４細胞期の各段階でRNAを抽出しつつも個体の発生が確認できた。培養細胞と同様に抽出したRNAを用いて次世代シーケンス用のRNA-seqライブラリを作製し、データを取得した。得られたデータは高い品質を有しており、時系列の遺伝子発現解析に活用できることが確認できた。HeLa細胞および線虫の受精卵を用いたデータは論文投稿に向けて解析を進めている。これらの取り組みに加えてマウス大腿骨から採取した造血前駆細胞を対象にしたナノエレクトロポレーションについて条件検討を進めた。検討の結果、培養細胞よりもやや高い電圧で非殺傷的にRNAの抽出が可能であることや電圧の向きを変えることで外来分子の導入が可能な条件を見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度から引き続きRNAの抽出条件を幅広く検討した。その結果、細胞の生存率を高く維持しつつ、比較的多くのRNAを抽出できる条件を見出した。これにより、大幅に研究が進展した。また、造血前駆細胞を対象にした条件検討では、細胞表面張力依存的に細胞膜に穿孔を形成し、さらに非殺傷的に外来分子を導入する方法を見出した。この現象を活用して、細胞表面張力と遺伝子発現を同時に計測する新しい計測技術を開発した。本計測技術に関する内容は論文としてまとめ、学術誌に投稿した。
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| 今後の研究の推進方策 |
ナノエレクトロポレーションに関する丹念な条件検討によりRNA抽出量を最大化しつつも、細胞の生存率を高く保つ電圧印加の方法を見出した。これにより大幅な研究の進展がみられた。HeLa細胞および線虫の受精卵を観察対象として見出した電圧印加法を適用し、細胞周期進行および個体の発生を観察しつつ、時系列の遺伝子発現解析が可能なことを確認した。最終年度は学術論文として纏めるためにデータをさらに積み重ねると共に、解析を進める。
以上に加えて、造血前駆細胞に対しても最適なナノエレクトロポレーションの電圧条件を見出し、外来分子を細胞表面張力依存的に細胞内へ導入することに成功した。細胞に導入した外来分子と内在性のRNAを同時かつ1細胞解像度で定量する新しい解析方法を開発し、その方法に関する学術論文をまとめることができた。論文が採択されるまで追加実験を行うとともに、新たな展開として細胞変形能と遺伝子発現の同時計測を可能にする技術の開発を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究代表者の所属機関が変更することが年度内に判明したため、2022年度内に研究内容を纏める活動を前倒しして進めた。その結果として、大幅な進捗が得られ、投稿論文として学術誌に投稿することができた。一方で、2022年度に計画していた実験の一部を2023年度初旬に進めることにしている。具体的には2022年度中に蓄積した次世代シーケンス解析用のサンプルを処理し、データの取得と解析を進める。
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