| 研究課題/領域番号 |
21K18262
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
東山 繁樹 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (60202272)
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| 研究分担者 |
小川 敦司 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (30442940)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2025-03-31
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| キーワード | K-Ras 変異 / がん治療 / DNAアプタマー / タンパク質分解 / ユビキチンリガーゼ |
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| 研究実績の概要 |
私たちの体には、タンパク質を一定量に保ったり、品質を管理したりするシステムとしてユビキチン・プロテアソームによるタンパク質分解システムがある。このシステムの一つを、膵がん、肺がん、大腸がん等、多くのがん種で高頻度に認められるK-Ras G12変異体３種(K-RasG12D/V/C)に指向性を持つようにする「基質指向性変換モジュレーター」分子を作製し、応用するのが本研究の目的である。標的タンパク質K-RasG12D/V/Cを特異的に認識する人工分子を、DNAアプタマーで作製する。DNAアプタマーの特異性は非常に高く、１アミノ酸置換の変異をも認識可能である。K-RasG12D/V/Cを特異的に認識するDN AアプタマーをCUL3型 ユビキチンリガーゼの基質受容体であるSPOP認識分子（低分子化合物またはSPOP認識 DNAアプタマー）に融合し、K-RasG12D/V/C指向性変換モジュレーターとして利用する。
2021年度は、まずはK-Ras変異体G12Dを特異的に認識するDN Aアプタマーの取得に向け、30個のランダムヌクレオチドを含む70塩基長の１本鎖DNAライブラリ（2.4×10の15乗 種）を初期プールとして、G12Dに対する競合的SELEX法を行い、当該タンパク質に特異的に結合するDNAアプタマーの獲得を試みた。競合的SELEXを、条件設定を変動させながら合計13ラウンド繰り返した。ラウンドが進むにつれて、G12Dにより強く結合するDNAが濃縮していることが明らかとなった。現在までに得られたDNAアプタマーは、WTに対してもほぼ同等の親和性を有していることから、G12Dへの特異性を上げるための競合的SELEXの条件設定の変更とDNAライブラリの組み直しを行ない、G12D特異的DNAアプタマーの取得を目指している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度は、30個のランダムヌクレオチドを含む70塩基長の１本鎖DNAライブラリ（2.4×10の15乗 種）を初期プールとして、多くのがん（膵がん、肺がんや大腸がん）で高頻度に認められるK-Ras変異体（G12D）に対する競合的SELEX法を行い、当該タンパク質に特異的に結合するDNAアプタマーの獲得を試みた。具体的には、G12Dおよび野生型K-Ras（WT）を小麦無細胞系で合成・ビオチン化し、それぞれ磁気ビーズおよびアガロースビーズに固定化したものを用いて（G12DおよびWT共存下で）G12Dのみに結合するDNAを回収・増幅する工程を、条件を厳しくしながら合計13ラウンド繰り返した。磁気ビーズ or G12Dに対する各ラウンド終了後のDNAライブラリの結合活性をqPCR法で調査したところ、ラウンドが進むにつれて、G12Dにより強く結合するDNAが濃縮していることが明らかとなった。一方で、WTに対しても同様の調査を行ったところ、同じラウンドで比較して、G12Dに対する結合活性よりはやや低いものの、WTに対しても同等の親和性で結合してしまうことが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度に行ったSELEXの13ラウンド終了後のDNAライブラリ（あるいは少し前のラウンドのDNAライブラリ）を用いて、競合的SELEXをさらに進める。なお、この際、WTとG12Dの濃度比をより大きくしていくことで（より厳しくしていくことで）、G12D特異的なDNAアプタマーの獲得を試みる。また、昨年度の競合的SELEXでは、条件の厳格化スピードが速かったために、「親和性がやや低くても特異性が高いアプタマー」を取りこぼしてしまった可能性がある。そこで、セカンドプランとして、条件の厳格化を緩やかにした改良版の競合的SELEXを（１ラウンドから）行うことも検討している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
COVID19感染蔓延の影響を受け、学会、研究会出席の旅費や研究者招聘等の人件費が全く動かすことができなかったことから、繰り越すこととなった。2022年度は、202１年度の成果報告のための学会、研究会発表や、関連領域研究者との交流を予定通り行う。また、 DNAアプタマー取得後は、培養細胞およびがん細胞担がんマウスを用いて、活性評価を前倒しで進める予定であり、その経費に充てる。
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