| 研究実績の概要 |
酵素カスケード反応に適した細胞内代謝経路の構築を行った。特に、補酵素であるNADH/NAD, NADPH/NADPのそれぞれのバランスに注目し,ペントースリン酸経路、Entner-Doudoroff 経路を強化することでこのバランスを制御を試みた。さらに、補酵素としてのメチル基リサイクル経路についても並行して検討を進めた。また、TCA回路の流量を制御することでも同様にこのバランスを制御可能である。これらの経路を強化するために、それぞれに適した遺伝子を導入した。NADH/NAD, NADPH.NADPのバランスにはあまり変化が見られなかったが、これはカスケード反応を入力していないためであると考えられる。並行して、反応のモデルとの１つとしてバニリン生産経路の構築を進めた。デヒドロシキミ酸からプロトカテク酸を経てバニリン酸、プロトカテクアルデヒドへと分岐し、そこからバニリンへと収束する。このモデル経路の構築のためにDSD, OMT, ACARの３つの遺伝子を導入して中間体及びバニリン生産を評価した。遺伝子導入によりバニリン生産が確認され、またそれぞれの酵素の発現量に応じて中間体を含む経路のそれぞれの代謝物が変動することが示された。これは、アンモニアイオンをもとにした窒素サイクルの活性が影響を与えている可能性が示唆された。炭素源など培養条件の検討を行い、また遺伝子発現量を再度検討することで、中間体がさまざまな割合で生産する微生物株を構築できた。一方で、生成したバニリンが引き続き分解されている可能性も示唆されていたが、これはアルコール誘導体へと変換されていることが明らかになった。これより、窒素サイクルをもとにして代謝活動に影響を与えることが可能であることが示された。
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