| 研究課題/領域番号 |
21K19048
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
堀 雄一郎 九州大学, 理学研究院, 教授 (00444563)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| キーワード | 小胞体ストレス / フォールディングセンサー |
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| 研究実績の概要 |
ミスフォールディングしたタンパク質の小胞体における異常蓄積は、小胞体ストレスを引き起こし、様々な疾病に深く関与することが知られている。このミスフォールディングタンパク質の検出は、小胞体ストレス機構の解明に寄与し、小胞体ストレスが関与する疾病の治療に貢献すると考えられる。前年度までの研究で、フォールディングセンサータンパク質の疎水場に結合することの知られているキサンテン系色素をPYPタグリガンドに結合させた蛍光プローブを開発した。その疎水場にはミスフォールディングタンパク質が結合することが知られており、色素がミスフォールディングタンパク質と疎水場への結合において競合し蛍光特性を変化させることができれば、ミスフォールディングタンパク質を検出することができる。この原理をもとに、昨年度に引き続き、疎水場に結合し蛍光強度を変化させると考えられる環境応答性色素について検討し、PYPタグリガンドに連結させたプローブの設計・合成及びタンパク質ラベル化反応について検証した。数種の環境応答性色素をPYPタグリガンドに結合させたプローブを設計・合成し、PYPタグをラベル化できるかを調べた。プローブとタンパク質を反応させ、SDS-PAGEを行ったところ、PYPタグと結合することが分かった。更には、ラベル化反応に伴い、蛍光強度を変化させることが分かった。更には、細胞の中でもこれらのプローブはPYPタグ融合タンパク質をラベル化できることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
フォールディングセンサーの疎水場に結合する環境応答性色素をPYPタグリガンドに連結したプローブ開発に成功した。更には、それらのプローブをin vitroに加え、生細胞中においても、タンパク質を特異的にラベル化できることを示した。一方、研究の途中で、所属機関を異動したため、新しい研究室のセットアップの間、研究ができない期間が生じた。このため、異動からセットアップの期間の分だけ、研究はやや遅れたが、当初の計画に従って着々と研究を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、フォールディングセンサータンパク質の発現・精製を行い、PYPタグラベル化技術と合わせてラベル化反応を検討し、更には、ミスフォールディングタンパク質と反応させ、色素・ミスフォールディングタンパク質の競合が起こり、蛍光強度が変化するか、また、細胞内でのミスフォールディングタンパク質の動態を可視化できるかを検証していく。また、細胞には、様々なストレスを付加し、その影響をプローブ技術により明らかにしていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
環境応答性色素を用いて、タンパク質をラベル化しイメージングする蛍光プローブを開発している過程で、より効率的に疎水場に応答して蛍光強度を変化させる色素を見出した。この結果、新たに環境応答性色素を検討し最適化する必要が生じた。研究遂行上、プローブの再作成と評価のための追加実験が必要となった。一方、これらの追加実験を行う必要があったものの、所属研究機関を異動したため、その際に機器移動や新しい研究室のセットアップにより、一定期間研究が遂行できなかった。そこで、次年度に、必要となる追加実験を行い、成果発表ならびに取りまとめを行うこととし、未使用額はその実験を行うための設備の経費に充てたい。
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