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2023 年度 実績報告書

人工プライベートシャペロンシステムの構築と難発現タンパク質生産への応用

研究課題

研究課題/領域番号 21K19084
研究機関岡山大学

研究代表者

安井 典久  岡山大学, 医歯薬学域, 准教授 (90467514)

研究分担者 山下 敦子  岡山大学, 医歯薬学域, 教授 (10321738)
研究期間 (年度) 2021-07-09 – 2024-03-31
キーワード分子シャペロン / 人工タンパク質 / 難発現タンパク質 / プライベートシャペロン / 組換えタンパク質 / ファージディスプレイ / ファージディスプレイライブラリー / モネリン
研究実績の概要

自然に見出されるプライベートシャペロンとその基質タンパク質のペアを人工的に再構成することを目指し,本研究で対象とした基質タンパク質の一つであるLDL受容体の細胞外領域に結合する人工タンパク質の作製を進めた。前年度において,人工タンパク質の分子骨格である一本鎖モネリンについて,その熱安定性が向上する変異を見いだしていた。この成果に基づき,人工タンパク質のファージディスプレイライブラリーを高度化した。高度化したファージディスプレイライブラリーをLDL受容体細胞外領域を構成する複数のLAモジュールに対し選別した。次いで,選別で得られた一本鎖モネリン変異体について,酵母ディスプレイ法を用いて各ドメインに対する特異性を網羅的に評価した。その結果,特定のLAモジュールに特異的に結合する2種類の人工タンパク質が見いだされた。この高い特異性は,LDL受容体ファミリーのプライベートシャペロンであるRAPが様々なLAモジュールに広範に結合することから,興味深い分子特性である。また,RAPの様に様々なLAモジュールに結合する人工タンパク質も同定した。高い特異性を示した人工タンパク質について,大腸菌で組換えタンパク質を生産し,アフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製タンパク質をゲルろ過クロマトグラフィーで分析した結果,単分散のピークを与えた。高い結合特異性の構造基盤を明らかにするために,人工タンパク質とLAモジュール断片からなる複合体の結晶構造解析を計画した。結晶化条件をスクリーニングした結果,複数の結晶が得られた。以上の通り,LDL受容体の細胞外ドメインに結合する人工タンパク質の作製に成功し,これらがLDL受容体のプライベートシャペロンとして機能するか否かを検証可能な段階に到達することができた。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2024 2023

すべて 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 2件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 5件) 学会発表 (1件)

  • [雑誌論文] Chemical range recognized by the ligand-binding domain in a representative amino acid-sensing taste receptor, T1r2a/T1r3, from medaka fish2024

    • 著者名/発表者名
      Ishida Hikaru、Yasui Norihisa、Yamashita Atsuko
    • 雑誌名

      PLOS ONE

      巻: 19 ページ: e0300981

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0300981

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Pivotal role for S-nitrosylation of DNA methyltransferase 3B in epigenetic regulation of tumorigenesis2023

    • 著者名/発表者名
      Okuda K、(中略16名)、 Yasui N、Yamashita A、Marusawa H、Matsushita Y、Katagiri T、Shibata T、Uchida K、Niu S-Y、Lang N B.、Nakamura T、Zhang K Y. J.、Lipton S A.、Uehara T
    • 雑誌名

      Nature Communications

      巻: 14 ページ: 621

    • DOI

      10.1038/s41467-023-36232-6

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Chloride ions evoke taste sensations by binding to the extracellular ligand-binding domain of sweet/umami taste receptors2023

    • 著者名/発表者名
      Atsumi Nanako、Yasumatsu Keiko、Takashina Yuriko、Ito Chiaki、Yasui Norihisa、Margolskee Robert F、Yamashita Atsuko
    • 雑誌名

      eLife

      巻: 12 ページ: e84291

    • DOI

      10.7554/eLife.84291

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [雑誌論文] Direct binding of calmodulin to the cytosolic C-terminal regions of sweet/umami taste receptors2023

    • 著者名/発表者名
      Yoshida Atsuki、Ito Ayumi、Yasui Norihisa、Yamashita Atsuko
    • 雑誌名

      The Journal of Biochemistry

      巻: 174 ページ: 451~459

    • DOI

      10.1093/jb/mvad060

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Investigating the Effect of Substituting a Single Cysteine Residue on the Thermal Stability of an Engineered Sweet Protein, Single-Chain Monellin2023

    • 著者名/発表者名
      Ohnuma Kyosuke、Yamashita Atsuko、Yasui Norihisa
    • 雑誌名

      The Protein Journal

      巻: 42 ページ: 698~708

    • DOI

      10.1007/s10930-023-10154-0

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] LDL受容体とそれを標的とする人工結合タンパク質の相互作用の構造基盤2023

    • 著者名/発表者名
      安井 典久,中村 祐介,山下 敦子
    • 学会等名
      第23回 日本蛋白質科学会年会

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公開日: 2024-12-25  

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