| 研究課題/領域番号 |
21K19193
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
加藤 大智 自治医科大学, 医学部, 教授 (00346579)
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| 研究分担者 |
山本 大介 自治医科大学, 医学部, 准教授 (90597189)
水島 大貴 自治医科大学, 医学部, 助教 (50843455)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| キーワード | 吸血昆虫 / 腸内フローラ / サシチョウバエ / ハマダラカ / リーシュマニア / マラリア |
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| 研究実績の概要 |
吸血昆虫の中腸は、吸血によって哺乳類から取り込まれた病原体がはじめて遭遇する昆虫の体内環境で、哺乳類から昆虫へのダイナミックな環境変化に適応して生存するためには様々なバリアが存在する。本研究では、吸血に伴って吸血昆虫の中腸に形成される「囲食膜」に着目し、それが形成されるメカニズム、病原体侵入阻止に果たす役割を解明し、さらには「囲食膜のバリア機能の強化」による伝播阻止法の開発を目指す。本年度の研究実績の概要は次の通りである。1）抗生物質投与によってマラリア原虫の感染が亢進したハマダラカで発現変動する遺伝子を、RNAseqおよびマイクロアレイにより解析した。RNAseq解析では、抗生物質投与によって4倍以上増加したものは13,611分子のうち、1日後は572、3日後は653、4倍以上減少したものは1日後は444、3日後は505であった。一方、マイクロアレイ解析では、抗生物質投与によって4倍以上増加したものは31,689プローブのうち、1日後は7、3日後は54、4倍以上減少したものは1日後は117、3日後は58であった。2）抗生物質を投与したハマダラカにおいて、囲食膜形成に関与すると考えられる遺伝子発現変動について定量PCRにより解析を行った。3）人工吸血系を用いて、サシチョウバエに分子量が異なる担体を結合させたFITCを取り込ませ、囲食膜形成の違いを検討した。4）人工吸血系を用いて、血液存在下および非存在下でサシチョウバエにリーシュマニア原虫を感染させた。液体培地を用いたグループでは原虫感染が亢進しており、囲食膜の形成について組織学的解析を行った。5）昆虫の囲食膜に含まれるキチンに結合することが報告されているクワの葉由来のラテックスタンパク質MLX56の組換えタンパク質を、大腸菌発現系を用いて作成した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
抗生物質をハマダラカに投与すると、マラリア原虫の感染が亢進することが知られている。このモデルを用いて、抗生物質投与の有無で、吸血後に蚊の体内でどのような分子レベルの変化が起きているのか、感染血の吸血1日後と3日後の遺伝子発現変動を、RNAseqとオリジナルのマイクロアレイによって解析した。変動する遺伝子を明らかにすることができたが、マイクロアレイ解析に比べ、RNAseq解析では遺伝子の発現差により大きな増幅が認められ、マイクロアレイ解析結果の方が標的遺伝子を絞りやすいように思われる。アノテーションされていない遺伝子がほとんどであるため、予想以上に解析が難航している。現在、囲食膜形成に関与すると考えられる分子について注目し、定量PCRによって解析を進めている。まだ予備実験段階ではあるが、いくつかの関連遺伝子の発現低下が認められた。また、人工吸血系を用いて、サシチョウバエでの囲食膜の形成について、組織学的解析を行っている。血液の存在の有無で、分子量が異なる担体を結合させたFITCを取り込ませ、囲食膜を通過する分子量に違いがあるのか比較検討している。さらに、クワの葉に含まれるキチン結合性のラテックスタンパクMLX56の組換えタンパクを、大腸菌発現系を用いて作成した。作成した組換えMLX56はキチンへの結合性を示した。この組換えMLX56をサシチョウバエに摂取させたが、このタンパク質の囲食膜への結合は確認できなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
1．囲食膜関連遺伝子の定量解析：抗生物質の投与によってマラリア原虫感染が亢進したハマダラカにおいて、特に囲食膜の形成に関連する遺伝子の発現変動に着目して詳細な解析を行う。
2．囲食膜形成における腸内細菌の役割：血液または液体培地を摂取させた吸血昆虫、抗生物質投与後に吸血させた吸血昆虫の囲食膜の形成過程を組織学的に検討する。また、囲食膜の構成成分であるPeritrophin1 (Per1)のmRNA発現を経時的に定量するとともに、Per1を認識する抗体（現在作製中）を用いて産生量の比較および免疫組織学的検討を行う。同時に、腸内細菌叢の量的・質的変化を定量PCR、次世代シークエンスにより解析する。
3．病原体感染における囲食膜のバリア機能の解析：血液存在下で原虫を感染させる際に、キチン分解酵素やキチン合成阻害剤を投与して囲食膜を破壊したり、Per1などの囲食膜の構成成分をノックダウンしたりすることで原虫感染が増強するのかを検討する。また、血液非存在下（液体培地）および抗生物質投与後に血液存在下で原虫を感染させた吸血昆虫における囲食膜の発達と原虫の発育・増殖について経時的に解析し、病原体侵入に対する囲食膜の役割を検証する
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| 次年度使用額が生じた理由 |
3月上旬には納品予定であった受託解析に遅れが出て年度を超えたことなど
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