研究課題
ＲＮＡは多岐にわたる重要な役割を担う生体高分子化合物である。多くの場合、ＲＮＡはパートナー蛋白質と複合体を形成することにより複雑な生体反応を実現している。そのため、ＲＮＡの機能を理解するにはＲＮＡと蛋白質の複合体の構造を原子レベルで明らかにすることが鍵となる。本研究では、ＲＮＡ配列をリボ ソームＲＮＡに挿入して表面に露出させ、ここに結合するタンパク質を結合させることにより、「ＲＮＡ-蛋白質複合体」をリボソーム表面に形成させ、これを丸ごと構造解析する技術を開発することにより、RNA科学の研究領域を加速することをめざす。前年度までにループに任意のRNAを挿入したリボソームを調製し、またそれに結合するタンパク質分子の調製系を構築した。当該年度は、RNA挿入リボソームを精製し、その構造解析を行った。まず精製したRNA挿入リボソームが安定な構造を形成していることをネガティブ染色電顕で観察したところ、野生型リボソームと同様に2つのrRNAサブユニットが会合した安定な会合構造を有していることがわかった。さらに、調製した複数のRNA挿入リボソームについて、クライオ電顕単粒子解析を実施した。野生型リボソームと同様のグリッド作成条件にて良質なグリッドを作成することができ、また、ハイエンドクライオ電顕を用いて良質なデータを収集することができた。得られたムービーを用いて構造解析を行なったところ、既存のリボソームと同様の手法にて高分解能の構造を得ることができ、RNA挿入リボソームも通常のリボソームと同様の画一的な手法にて高分解能構造を得ることができることが示された。さらに、明らかにった構造では、挿入したRNAの立体構造を可視化することができた。
2: おおむね順調に進展している
いずれのRNA挿入リボソームの立体構造も野生型リボソームの構造解析の手法と同様の画一的な方法で決定することができ、本研究の核となるRNA挿入リボソームの構造解析技術の妥当性が実証できたことから、順調に研究が進んだと考えている。
リボソームのループに挿入されたRNAの立体構造を容易に決定できる技術を構築できたため、今後は、ここにタンパク質を結合させ、タンパク質-RNA複合体として立体構造を決定することが重要である。一部のタンパク質は可溶性分子として安定に精製することができていないため、タンパク質の調製条件を検討することが重要である。タンパク質試料が調製できた後は、RNA挿入リボソームに過剰量のタンパク質を添加して複合体を形成させ、立体構造を決定する。
研究を進める中で、一部のタンパク質が不安定であることがわかり、安定に存在できる溶液条件を検討する必要がでてきたため、研究期間を延長して実験を行う計画である。タンパク質調製や構造解析のための消耗品として使用する。
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