| 研究課題/領域番号 |
21K19215
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
大嶋 篤典 名古屋大学, 細胞生理学研究センター, 教授 (80456847)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2023-03-31
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| キーワード | Large Pore Channel / クライオ電子顕微鏡 / ゲーティングモデル / ナノディスク再構成 |
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| 研究実績の概要 |
Large pore channelとして知られるヒトパネキシン1(PANX1)のクライオ電子顕微鏡による高分解能構造解析を行った。PANX1を発現精製ののち、脂質ナノディスクに再構成してチャネルが脂質に埋まった状態のタンパク質粒子を再現性良く得ることができた。PANX1のアポ状態と、阻害剤添加条件、C末欠失変異体、N末欠失変異体の4条件についてクライオ電子顕微鏡を用いて構造解析を行った。PANX1apoはN末端がチャネル通路内でファネルを形成し、通路を大きく開けている構造であるのに対し、PANX1-PBNはN末端領域が細胞質側に大きく構造変化すると同時に、脂質がチャネルの内側に存在することが確認され、チャネルの通路をブロックする密度が確認された。共同研究の電気生理学実験によって、PBNがチャネルの活性を低下させることが確認されたことから、PANX1-PBNは、チャネルが機能的に閉じた構造を示唆する一方、PANX1apoとPANX1ΔCは活性を示したことからオープンの状態を示していると解釈された。また、PANX1ΔNは全くチャネル活性を示さず、PANX1ΔNのチャネル活性は無いと判断した。クライオ電子顕微鏡構造解析により、隣接するサブユニットの隙間に脂質が存在していることが明らかとなった。これらのサブユニットの境界を埋める脂質の動的構造変化を検証するため、共同研究によりMDシミュレーションを行った。その結果、サブユニットの隙間を縫うようにして脂質がチャネルの通路に出入りする可能性が示唆された。これらの結果を総合して、脂質がPANX1と相互作用しながらチャネル通路内へ移動する「脂質ゲーティングモデル」を提示した。この結果は論文としてまとめ、発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
すでに計画していた構造解析には成功し、PANX1の脂質ゲーティングモデルの提示を論文にて発表することができた。PANX1の発現精製の再現性が非常に安定しており、ナノディスク再構成もほぼトラブルなく作製できたことが大きな要因である。また、コロナウイルスの影響で出張制限があったものの、凍結試料を送付するだけでクライオ電子顕微鏡データ収集を行っていただき、返却したデータを計算することで構造解析に成功した。作製した試料のクオリティが高かったことが要因と思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
ナノディスク再構成したPANX1の構造解析に成功したので、今後はさらにネイティブ環境を模倣した構造解析を実現するため、現在リポソーム膜に再構成した状態のPANX1チャネルの構造研究に取り組んでいる。これが実現できれば、膜の内外でバッファ組成の不均衡性を生じさせて構造解析できるため、より生理的条件下での膜タンパク質の構造研究ができると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナウイルスの影響で出張費が大幅に減少したことと、次年度から技術補佐員を雇用する予定であるため。
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