| 研究課題/領域番号 |
21K19219
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
三好 知一郎 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (60378841)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2024-03-31
|
| キーワード | Alu / レトロトランスポゾン / 転移 / LINE-1 / ゲノム |
|---|
| 研究実績の概要 |
現在、Aluの転移をモニターするレポーターコンストラクトは、G418耐性遺伝子ただ1種類しか存在しない。このためコロニー形成能の低い細胞株や既に遺伝子改変によりG418耐性となっている細胞株についてはAluの転移を観察することができない。そこでAluの転移アッセイをより多くの細胞株に適用し、かつその制御因子を広範に探索するための遺伝学スクリーニングへと発展させるために、これを蛍光蛋白質によって可視化する手法の開発に取り組んだ。初年度は、転移を可視化するための候補コンストラクトを複数作成した。本年度は、これらを改変して多くの細胞株に用いることができる汎用ベクターと組み合わせることで実用化を目指した。そのためにL1のORF2pとAluの転移可視化コンストラクトを共発現するベクターを新たに作成し細胞に導入したところ、これまでに報告されているG418耐性遺伝子で得られたAluの転移頻度と、蛍光蛋白質で可視化した場合で、ほぼ同等の転移頻度が観察された。またこれはL1の逆転写酵素活性を失活させると蛍光蛋白質を発現する細胞がほとんど観察されなかったことから、Aluの転移を蛍光蛋白質で可視化し、定量化することが可能であることを示唆している。しかし、今後ゲノム解析をすすめ、本当にAluがゲノム内に挿入されたのかを確認する必要がある。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Aluの転移を可視化する新たなレポーターコンストラクトを構築することにほぼ成功した。現在これらの蛍光蛋白質陽性細胞からゲノムDNAを取得しており、本当にAluがゲノム内に挿入されたのかを確認する必要があるが、Alu転移解析の基盤技術が整いつつあるといってよい。蛍光タンパク質を利用して、Aluの転移細胞をFACS解析によって定量化する手法を確立し、ソーティングする技術と組み合わせて、遺伝学的スクリーニングを実施を目指す。
|
| 今後の研究の推進方策 |
上記で記載したように、今後蛍光タンパク質を利用して、Aluの転移細胞をFACS解析によって定量化する手法を確立し、ソーティングする技術と組み合わせて、遺伝学的スクリーニングを実施を目指す。そのためにはCas9の恒常的な発現細胞株を樹立し、ノックアウト効率が高いクローンを選別する必要があるので、Aluの転移を許容する細胞株を主にこの作成に取り組んでおり、これまでに候補クローンを得つつある。またこれまでにL1 ORF2pはAlu転移に必要であるが、これと相互作用する因子を質量分析によって取得しその解析をすすめるも、対象因子が膨大であるため、これまでに得た生化学的解析結果を今後取得する遺伝学的スクリーニングで得られたAlu制御因子と比較することが重要だと考えられる
|
