光駆動型神経機能素子の開発

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K19229
• 研究機関: 香川大学
• 研究代表者: 藤原 祐一郎 香川大学, 医学部, 教授 (20532980)
• 研究分担者: 川鍋 陽 香川大学, 医学部, 講師 (10707128)
• 研究期間 (年度): 2021-07-09 – 2024-03-31
• キーワード: イオンチャネル

研究実績の概要

新しいタイプの光駆動性イオンチャネルおよび光駆動性膜機能蛋白質を創製することを目的とする。光異性化を起こすアゾベンゼンを利用して、光によるイオンチャネル活性の制御を行う。共通する機能ドメインをターゲットにすることで、多くのイオンチャネルファミリーに適用できるため、これまでの光駆動性ツール(藻類由来チャネルロドプシン)にはない、ネイティブ神経チャネルの高いイオン選択性と軸索細胞膜局在・アクセサリー分子の会合を保つ光駆動性チャネルを次々に作成することが可能となる。これらの取り組みにより、分子構造や動作機構に立脚して戦略的に光駆動性チャネル・光駆動性膜蛋白を創製するプラットフォームを構築する。
本年度は、BmGr9チャネルを用いて、さらに多くの光駆動性チャネルを手に入れることを試みた。網羅的に細胞外からアゾベンゼン誘導体がアクセスできる残基にCys変異を導入し、アゾベンゼンが架橋し光により駆動するチャネルを新たに数種類手に入れた。これまで手に入れた光駆動チャネルを用いて、アゾベンゼン誘導体の種類・長さを変えた実験を行い、適切な残基間架橋距離を見出した。電気生理学実験システムをプログラムした波長で自動で照射できる機器を組み合わせて改良を行い、実験の効率化を図った。
出来上がった光駆動チャネルを用いて、イオンチャネルの開閉機構を検討した。残基間距離を測定することができたため、その距離情報をもとに構造モデル（開閉モデル）を作成することに成功した。また、光照射ゲーティングと、リガンド感受ゲーティングを比較検討・実験を行うことにより、リガンド感受ゲーティングの仕組みに迫る結果を得ることができた。
分子動力学計算により、BmGr9チャネルの定常状態の構造をシミュレーションした。今後、光駆動実験で得られた残基間距離情報をもとに、ゲーティングモデルを構築しシミュレーションする予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

BmGr9チャネルの開閉を光照射によりコントロールすることに成功し、さらに多くの光照射チャネルを得ることができたため。次年度は、このチャネルを基盤として、発展的にチャネルの構造機能相関、細胞機能の光操作実験に進むことができるため。
本研究費で実験補助員(1名)を雇用し、光照射実験をプログラム化することに成功し、Cys導入変異体作成から電流解析まで一連の自動解析システムを構築することに成功した。次年度以降に、解析システムが有効に働くことが期待できるため。本年度得られた結果を学会にて発表することができたため。また、計算科学との共創や多くの発展が得られたため。

今後の研究の推進方策

本年度は、扱いやすいBmGr9チャネルを用いて実験を進め、変異体作成から電流解析まで一連の解析システムを構築することに成功した。チャネルの開閉を光照射によりコントロールすることに成功し、アゾベンゼン誘導体の分子長をもとに変異残基間距離の情報を得た。次年度は、BmGr9チャネルを基盤として、距離情報を用いて、どのようにチャネルが光で開閉するのかを明らかにする構造機能相関研究、細胞機能を光でコントロールすることを試みる。また、Hvチャネルに対して構造－機能解析・分子計算まで含めて、これまで最も研究の進んでいる電位センサーを有する電位依存性チャネルを対象として研究を進める。本年度は、分子動力学計算により、BmGr9チャネルの定常状態の構造をシミュレーションした。今後、光駆動実験で得られた残基間距離情報をもとに、ゲーティングモデルを構築しシミュレーションする予定である。

次年度使用額が生じた理由

発注試薬の納期の遅れ、および計算科学を取り入れて研究を遂行する必要が生じたため学内計算機器設備による分子構造計算を取り入れて研究を行ったため、物品費の使用に遅れが生じた。実験補助員の雇用が短期間で終了したため、人件費の使用に遅れが生じた。社会情勢の変化により旅費が使用できなかった。
翌年度分として請求した助成金と合わせた、直接経費（2,753,929円）の使途は以下の通り。
物品費：1,600,000円、旅費：100,000円、人件費：1,000,000円、その他：53,929円。

研究成果

• [雑誌論文] Rhodopsin-bestrophin fusion proteins from unicellular algae form gigantic pentameric ion channels (2022)
  • 著者名/発表者名: Rozenberg A, Kaczmarczyk I, Matzov D, Vierock J, Nagata T, Sugiura M, Katayama K, Kawasaki Y, Konno M, Nagasaka Y, Aoyama M, Das I, Pahima E, Church J, Adam S, Borin VA, Chazan A, Augustin S, Wietek J, Dine J, Peleg Y, Kawanabe A, Fujiwara Y, Yizhar O, Sheves M, Schapiro I, 他6人
  • 雑誌名: Nature Structural & Molecular Biology 巻: 29 ページ: 592～603
  • DOI: 10.1038/s41594-022-00783-x
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Creation of Photoswitchable Ion Channels and Measurement of Their Dynamic Structural Changes (2023)
  • 著者名/発表者名: 藤原 祐一郎1,2、平野 磨生子1、神鳥 和代1,2
  • 学会等名: 第100回日本生理学会大会
• [学会発表] 電位依存性プロトンチャネルHv1はATPと直接結合して活性調節を受ける (2023)
  • 著者名/発表者名: 川鍋 陽1、高田 麻紀1、竹下 浩平2、藤原 祐一郎1
  • 学会等名: 第100回日本生理学会大会
• [学会発表] 膜の張力と脂質による電位依存性H+チャネル活性制御機構 (2023)
  • 著者名/発表者名: 高田 麻紀1、竹下 浩平2、川鍋 陽1、藤原 祐一郎1
  • 学会等名: 第100回日本生理学会大会
• [学会発表] Functional regulation and intermolecular interaction of phosphoinositides on potassium channel KcsA (2023)
  • 著者名/発表者名: 紀谷 拓音1、竹下 浩平2、川鍋 陽1、藤原 祐一郎1
  • 学会等名: 第100回日本生理学会大会
• [学会発表] Sodium-glucose cotransporters (SGLT) in Ciona intestinalis transports various kinds of sugar (2023)
  • 著者名/発表者名: 神鳥 和代1,2、藤原 祐一郎1,2
  • 学会等名: 第100回日本生理学会大会