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最終年度は以下の２項目を実行した。
(1) RADICL-seqの実施
初年度に引き続き、4OHT添加によりPRC1欠失を誘導できるマウスメスTS細胞を用いてRADICL-seqを行なった。解析の結果、PRC1欠損細胞ではXist RNAのＸ染色体への結合は約５０％減少しており、代わりに常染色体への結合が増加することが明らかになった。このことはRNA FISH解析で半数程度の細胞がXist RNAの拡散を示すことと矛盾がない。さらにgenome-wideに解析を行い、Xist RNAと同様にPRC1欠損下でクロマチンとの結合が減少するncRNAの探索を行ない、いくつかの候補を同定した。
(2) Live-cell imaging の実施
PRC1を欠損した状態で細胞核内に分散したXist RNAの時空間挙動を明らかにするためにXist RNAのlive-imagingを行った。Xist RNAをGFPシグナルとして可視化できる細胞をすでに作製しており、本研究ではさらに4OHT添加でRing1A/Bを欠失できるように遺伝子改変を加えたTS細胞を構築した。この細胞を用いてRING1A/B欠損下でのXist RNA (GFP)の局在を解析したところ、固定した細胞と同様に約半数の細胞でXist (GFP)が細胞核内に拡散することが観察された。次にこれらの細胞を用いて１分間隔で１０分間の3D time-lapseデータを取得して解析した結果、この時間枠内では細胞核内に拡散したXist (GFP)は大きな空間移動を示さないことが明らかとなった。上述のRADICL-seq解析から、PRC1欠損時にはXist RNAが常染色体DNAと結合する傾向が分かっており、live-imagingの結果を考慮すると、細胞核内に拡散したXist RNAが常染色体に安定に結合した状態で存在することが示唆された。
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