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2022 年度 実施状況報告書

エネルギー分配の分子メカニズムの解明ー淡水の1次消費者ミジンコをモデルとしてー

研究課題

研究課題/領域番号 21K19298
研究機関大阪大学

研究代表者

加藤 泰彦  大阪大学, 大学院工学研究科, 准教授 (60415932)

研究期間 (年度) 2021-07-09 – 2024-03-31
キーワードエネルギー分配 / DNMT3 / ミジンコ / DNAメチル化
研究実績の概要

オオミジンコにおいて、哺乳類の de novo DNA メチル化酵素3(DNMT3)のオーソログをコードしている DNMT3.1 遺伝子は、オオミジンコが摂取するエネルギーの減少に伴って、成長と繁殖の間のエネルギー分配を決定する。これは、DNMT3.1 発現細胞がエネルギー分配の中枢細胞であることを強く示唆するものである。DNMT3.1 が制御する遺伝子ネットワークを明らかにするために、昨年度に引き続き本年度は DNMT3.1 遺伝子座に蛍光タンパク質遺伝子をノックインし、DNMT3.1 発現細胞を蛍光ラベルすることを試みた。昨年度に DNMT3.1のイントロンを狙って切断する TALEN を設計し卵に注入すると予想外に毒性が高いことが判明した。このため、異なるイントロンを狙った TALEN の設計を試みたが標的配列の GC 含量等の問題により設計が困難であることが明らかとなった。そこで、より標的配列の設計の自由度が高い CRISPR/Cas9 を用いることとした。複数の gRNA を設計し、各 gRNA を Cas9 と卵に注入することで切断能を評価したところ、切断能力の高い gRNA を見出した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

DNMT3.1 遺伝子座を切断する標的配列の選定に時間がかかったため、DNMT3.1 発現細胞を可視化できる遺伝子組換えミジンコを作出することができなかった。

今後の研究の推進方策

本年度見出した gRNA を用いたノックイン実験を行う。そして、形質転換体を利用して飢餓ストレスを与えた個体から DNMT3.1 発現細胞を蛍光により分取し、トランスクリプトーム解析、DNA メチル化解析を行う。その後、当初の計画通り、飢餓ストレス以外の温度、重金属、農薬などの環境要因に依存した DNMT3.1 発現細胞の遺伝子発現、DNA メチル化解析と統合することで、DNMT3.1 によって制御される遺伝子ネットワークを解明する。

次年度使用額が生じた理由

DNMT3.1 遺伝子座への蛍光タンパク質遺伝子のノックインに想定していた以上に時間を要しており、目的の遺伝子組換え体を作製することができず、これを用いた細胞解析を依頼することができなかった。このため解析依頼経費が未使用になってしまった。しかし本解析は研究遂行に不可欠であるため、2023年度は当初計画通りの研究実施に加え、2021年度から繰り延べている解析依頼も行う予定である。未使用額は当初目的のまま、この解析依頼経費に充てる。

  • 研究成果

    (14件)

すべて 2023 2022

すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 2件、 オープンアクセス 4件) 学会発表 (9件) (うち国際学会 2件、 招待講演 3件)

  • [雑誌論文] Neonatal administration of synthetic estrogen, diethylstilbestrol to mice up-regulates inflammatory Cxclchemokines located in the 5qE1 region in the vaginal epithelium2023

    • 著者名/発表者名
      Kitamura Ayaka、Jiayue Chen、Suwa Tomoya、Kato Yasuhiko、Wada Tadashi、Watanabe Hajime
    • 雑誌名

      PLOS ONE

      巻: 18 ページ: e0280421

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0280421

    • オープンアクセス
  • [雑誌論文] Regulation of Doublesex1 Expression for Environmental Sex Determination in the Cladoceran Crustacean Daphnia2022

    • 著者名/発表者名
      Kato Yasuhiko、Watanabe Hajime
    • 雑誌名

      Frontiers in Cell and Developmental Biology

      巻: 10 ページ: 881255

    • DOI

      10.3389/fcell.2022.881255

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] CELF1 represses Doublesex1 expression via its 5’ UTR in the crustacean Daphnia magna2022

    • 著者名/発表者名
      Tirta Yusrifar Kharisma、Adachi Shungo、Perez Christelle Alexa Garcia、Adhitama Nikko、Nong Quang Dang、Natsume Toru、Kato Yasuhiko、Watanabe Hajime
    • 雑誌名

      PLOS ONE

      巻: 17 ページ: e0275526

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0275526

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] 湖沼のヒロイン,ミジンコを分子の言葉で理解する2022

    • 著者名/発表者名
      加藤 泰彦
    • 雑誌名

      生物工学会誌

      巻: 100 ページ: 383~383

    • DOI

      10.34565/seibutsukogaku.100.7_383

    • オープンアクセス
  • [雑誌論文] The Mechanism for Establishing the Binary Sex with Environmental Signals in the Crustacean Daphnia magna2022

    • 著者名/発表者名
      Kato Yasuhiko、Watanabe Hajime
    • 雑誌名

      Spectrum of Sex

      巻: - ページ: 203~219

    • DOI

      10.1007/978-981-19-5359-0_12

  • [学会発表] ゲノム編集ミジンコの作出と環境依存型性決定機構の解析への応用2022

    • 著者名/発表者名
      加藤泰彦、渡邉肇
    • 学会等名
      日本ゲノム編集学会第7回大会
    • 招待講演
  • [学会発表] ノックイン技術で迫るミジンコにおける環境依存的な性決定の仕組み2022

    • 著者名/発表者名
      加藤泰彦、渡邉肇
    • 学会等名
      日本動物学会 第93回早稲田大会
    • 招待講演
  • [学会発表] ミジンコの環境依存型性決定における doublesex1 遺伝子の発現制御2022

    • 著者名/発表者名
      加藤泰彦、渡邉肇
    • 学会等名
      第8回生殖若手の会
    • 招待講演
  • [学会発表] オオミジンコにおける有用タンパク質高発現ベクターの構築と利用2022

    • 著者名/発表者名
      柴田成樹、リー デイビッド、アディタマ ニッコ、加藤泰彦、渡邉肇
    • 学会等名
      第74回日本生物工学会大会
  • [学会発表] オオミジンコにおけるCRISPR/dCas9を利用した遺伝子発現活性化システムの開発2022

    • 著者名/発表者名
      原あや乃、アディタマ ニッコ、加藤泰彦、渡邉肇
    • 学会等名
      第74回日本生物工学会大会
  • [学会発表] Fluorescence live imaging of the apoptotic effects induced by a juvenile hormone analog, fenoxycarb, in the developing ovary of Daphnia magna2022

    • 著者名/発表者名
      Lichi Hsieh、Nikko Adhitama、Yasuhiko Kato、Hajime Watanabe
    • 学会等名
      第 45 回日本分子生物学会大会
  • [学会発表] 甲殻類オオミジンコにおけるサーチュイン1遺伝子の機能解析2022

    • 著者名/発表者名
      平野啓太、アディタマ ニッコ、加藤泰彦、渡邉肇
    • 学会等名
      第 45 回日本分子生物学会大会
  • [学会発表] Analysis of the transactivation region of the 5´ UTR overlapping lncRNA DAPALR in the crustacean Daphnia magna2022

    • 著者名/発表者名
      Yasuhiko Kato、Christelle Alexa G Perez、Hajime Watanabe
    • 学会等名
      Cold Spring Harbor Asia (CSHA) RNA Biology
    • 国際学会
  • [学会発表] The RNA binding protein CELF1 represses the male determining gene Doublesex1 via its 5_ UTR in the crustacean Daphnia magna2022

    • 著者名/発表者名
      Yusrifar K Tirta、Shungo Adachi、Christelle Alexa G Perez、Nikko Adhitama、Quang Dang Nong、Toru Natsume、Yasuhiko Kato、Hajime Watanabe
    • 学会等名
      Cold Spring Harbor Asia (CSHA) RNA Biology
    • 国際学会

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公開日: 2023-12-25  

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