コロナウイルス制圧のための新規膜融合阻害ペプチドの創出と合理的な設計法の確立

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 21K19366
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 児玉 栄一 東北大学, 災害科学国際研究所, 教授 (50271151)
• 研究分担者: 大石 真也 京都薬科大学, 薬学部, 教授 (80381739)
• 研究期間 (年度): 2021-07-09 – 2024-03-31
• キーワード: SARS-CoV-2 / 創薬 / 膜融合 / ヘリックス / ペプチド

研究実績の概要

本研究は、ウイルス膜融合をモデルとしてヘリックス相互作用を阻害することによって効率的で汎用性の高いタンパク機能阻害剤の開発方法を提案することを目的にしている。方法論の確立に迅速な社会実装が望まれる新型コロナウイルスをモデルとして取り組む。本ウイルスの侵入機序はClass I膜融合であり、この膜融合にスパイクタンパクC末端側に位置するウイルスエンベロープ貫通ドメインを有するS2サブユニットが重要な役割を果たす。このS2サブユニットには特徴的な2つのヘリックス構造（heptad repeat 1と2; それぞれHR1とHR2と略す）があり、このヘリックス相互作用によるS2サブユニットの構造変化が膜融合に重要である。この構造変化阻害のためS2サブユニットを標的としたペプチド設計法とin vitro 耐性誘導を組み合わせ、１）設計-２）評価-３）耐性ウイルス誘導-４）耐性機序の解明-５）耐性機序を利用したペプチド創製（最終段階の５）は１）の設計につながる）といった工程を繰り返すことにより、より強力で薬剤耐性を生じにくい阻害剤を効果的にかつ短期間に開発することを目指す。本年度は、効率的な抗ウイルス活性の評価方法として非感染系で迅速にハイスループットが期待できる独自のELISA法と培養細胞と感染性ウイルスを用いる従来評価法を応用し、より安全で短期間にできるMTT色素法を組み合わせたペプチド活性評価を実施した。これらを駆使し、ウイルス感染を抑制しうる重要なアミノ酸配列の同定、複数の候補ペプチド配列を同定している。また、オミクロン株を加えた新たなウイルスパネルも構築しつつある。本年度の進捗は順調である。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

Class I膜融合をおこす新型コロナウイルスは、細胞侵入に重要な役割を果たすスパイクタンパクのうち、C末端側に位置するウイルスエンベロープ貫通ドメインを有するS2サブユニットをもつ。本研究では我々が確立したS2サブユニットを標的としたペプチド設計法とin vitro 耐性誘導を組み合わせ、１）設計-２）評価-３）耐性ウイルス誘導-４）耐性機序の解明-５）耐性機序を利用したペプチド創製、最終段階の５）は１）の設計につながるため、実際には 4 工程を繰り返すことにより、より強力で薬剤耐性を生じにくい阻害剤を効果的にかつ短期間に開発することを目的としている。昨年度に確立したふたつの効率的な抗ウイルス活性の評価方法を用いて実際に合成ペプチドの活性を検討した。ひとつは、非感染系で行うことができ、ハイスループットが期待できるELISA法であり、3時間以内にその評価を可能とする。本方法は細胞等を利用しないため、培養中に起こりうる標的細胞に対する毒性やペプチドの分解などを考慮する必要がなく、ヒットペプチドを同定しやすい特徴を持つ。ふたつめには標的細胞としてアフリカミドリザル由来のVero細胞と感染性ウイルスを用いる従来評価法を応用し、より安全で短期間にできるMTT色素法を組み合わせた培養評価系である。後者は実際の感染をin vitroで評価することができる。これらを駆使し、構造学的にヘリックス構造に必須の51残基の両端からアミノ酸を削除していったペプチドを約20種類合成し、ウイルス感染を抑制しうる重要な3か所のアミノ酸配列を同定することができた。ペプチド長を短くするためにこの3か所のうち2か所を有するペプチドを複数合成したが、一か所でも削除するとそのいずれでも活性が低下した。特にHR2領域中央にある部位は重要であり、アミノ酸置換で劇的に活性が低下した。

今後の研究の推進方策

令和４年度に確立したELISA法とVero細胞-ウイルス感染系による評価系から得られたペプチド配列から融合阻害に必須な部位が同定されたため、ウイルス由来配列をベースとした野生型ペプチドおよびアミノ酸置換を有するペプチドの評価を行う。融合を阻害するペプチドの活性にヘリックス構造が大きく関与することが他のウイルスで証明されており、新型コロナウイルスにおいてもヘリックス性が活性に関連するのか、検討する。関連があればヘリックス構造に寄与するアミノ酸置換を行い、より活性が高く、特異性に優れたペプチドを創製し、その効果を再度ELISAと細胞と感染性ウイルスを用いた測定系で確認する。具体的にはペプチドサイズとしては40アミノ酸長を下回ると阻害効果が弱まることから、阻害に重要なアミノ酸やHR1との結合面に位置しないアミノ酸を静電作用でヘリックス構造の安定性を強化するアミノ酸に置換し、効果増強をR5年度に試みる。阻害活性が十分であるペプチドを同定できた場合は、その耐性誘導をdose escalating法を用いて開始し、順次、ペプチド感受性とスパイクタンパク領域のアミノ酸変異を決定し、作用機序と耐性機序の解明に役立たせる。有意なアミノ酸置換を同定した場合は、その変異を有するペプチドを化学合成し、CDスペクトル解析におり二次構造及びその安定性を評価する。また、これまで出現したスパイクタンパクに変異を有するオミクロンなどのvariantsに対する効果を検討するため、これらのウイルスを入手し、効率的な培養方法を確立、評価系確立に役立たせる。これらの知見を総合して新たなペプチドを創製し、抗ウイルス活性を評価、耐性ウイルス誘導を再度行い、さらなる有望なペプチド創製を目指す。

次年度使用額が生じた理由

コロナ禍が収まっておらず、学会参加をweb等で行っており、旅費等の支出がなくなっている。実験補助員もコロナ禍で応募がなかったが、年度途中から配置可能となったため、次年度使用が生じた。新規に大学院生がさらに1名加わり、研究の進捗に問題はない。

研究成果

• [雑誌論文] Reduction strategies for inpatient oral third-generation cephalosporins at a cancer center: an interrupted time-series analysis (2023)
  • 著者名/発表者名: Naoya Itoh, Takanori Kawabata, Nana Akazawa, Daichi, Kawamura, Hiromi Murakami, Yuichi Ishibana, Eiichi N Kodama, and Norio Ohmagari.
  • 雑誌名: PLOS ONE 巻: 18(2) ページ: e0281518
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0281518.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Establishing an Accurate and Sensitive In Vitro Drug Screening System for Human Adenovirus Infection with Human Corneal Cells (2023)
  • 著者名/発表者名: Mina Sasano, Hironori Hayashi, Kumi Kawaji, Emiko Usui, Eiich N Kodama.
  • 雑誌名: Virology 巻: 581 ページ: 34-38
  • DOI: 10.1016/j.virol.2023.02.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Nasopharyngeal SARS-CoV-2 is not dispersed by high-flow nasal cannula. (2023)
  • 著者名/発表者名: Tetsuya Suzuki, Shinichiro Morioka, Kei Yamamoto, Sho Saito, Shun Iida, Katsuji Teruya, Jin Takasaki, Masayuki Hojo, Kayoko Hayakawa, Satoshi Kutsuna, Sho Miyamoto, Seiya Ozono, Tadaki Suzuki, Eiichi N Kodama, Norio Ohmagari.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 13 ページ: 2669
  • DOI: 10.1038/s41598-023-29740-4.2023
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Effects of infectious disease consultation and antimicrobial stewardship program at a Japanese cancer center: An interrupted time-series analysis. (2022)
  • 著者名/発表者名: Naoya Itoh, Nana Akazawa, Eri Kanawaku, Hiromi Murakami, Yuichi Ishibana, Daichi Kawamura, Takanori Kawabata, Keita Mori, Eiichi N. Kodama, Norio Ohmagari.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 17 ページ: e0263095
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0263095
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Antiviral Activity and Resistance Profile of the Novel HIV-1 Non-Catalytic Site Integrase Inhibitor, JTP-0157602. (2022)
  • 著者名/発表者名: Yoshitsugu Ohata, Mitsunori Tomonaga, Yasuo Watanabe, Keiko Tomura, Koji Kimura, Tatsuo Akaki, Kaoru Adachi, Eiichi N Kodama, Yuji Matsuzaki, Hironori Hayashi.
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 96 ページ: e01843-21
  • DOI: 10.1128/JVI.01843-21
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Factors associated with prolonged psychological distress among nurses and physicians engaged in COVID-19 patient care in hospitals in Singapore and Japan. (2022)
  • 著者名/発表者名: Shinichiro Morioka, Ban Hock Tan, Hiroe Kikuchi, Yusuke Asai, Tetsuya Suzuki, Shinobu Ashida, Satoshi Kutsuna, Sho Saito, Kayoko Hayakawa, Thuan Tong Tan, Eiichi Kodama, Norio Ohmagari.
  • 雑誌名: Frontiers in Psychiatry 巻: 13 ページ: 781796
  • DOI: 10.3389/fpsyt.2022.781796
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Serine hydroxymethyltransferase as a potent target of antibacterial agents acting synergistically with one-carbon metabolism-related inhibitors. (2022)
  • 著者名/発表者名: Yuko Makino, Chihiro Oe, Kazuya Iwama, Satoshi Suzuki, Akie Nishiyama, Kazuya Hasegawa, Haruka Okuda, Kazushige Hirata, Mariko Ueno, Kumi Kawaji, Mina Sasano, Emiko Usui, Toshiaki Hosaka, Yukako Yabuki, Mikako Shirouzu, Makoto Katsumi, Kazutaka Murayama, Hironori Hayashi, Eiichi N. Kodama.
  • 雑誌名: Communications Biology 巻: 5 ページ: 619
  • DOI: 10.1038/s42003-022-03555-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Change in Use of Pediatric Oral Antibiotics in Japan: Pre and post AMR action plan. (2022)
  • 著者名/発表者名: Noriko Iwamoto, Naho Morisaki, Kazuhiro Uda, Masashi Kasai, Eiichi Kodama, Norio Ohmagari, Isao Miyairi.
  • 雑誌名: Pediatrics International 巻: 64 ページ: e15197
  • DOI: 10.1111/ped.15197
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Interferon lambda 3 in the early phase of coronavirus disease-19 can predict disease progression. (2022)
  • 著者名/発表者名: Tetsuya Suzuki. Noriko Iwamoto, Shinya Tsuzuki, Yuko Kakumoto, Michiyo Suzuki, Shinobu Ashida, et. al.
  • 雑誌名: European Journal of Clinical Investigation 巻: 52 ページ: e13808
  • DOI: 10.1111/eci.13808
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Comparison of Sputum Specimens and Nasopharyngeal Swab Specimens for Diagnosis of Acute Human Metapneumovirus-related Lower Respiratory Tract Infections in Adults. (2022)
  • 著者名/発表者名: Takehiro Yajima, Hiroshi Takahashi, Nozomu Kimura, Kosuke Sato, Daisuke Jingu, Satoshi Ubukata, Makoto Shoji, Hiroshi Watanabe, Eiichi N. Kodama, Hidekazu Nishimura.
  • 雑誌名: Journal of Clinical Virology 巻: 154 ページ: 105238
  • DOI: 10.1016/j.jcv.2022.105238
  • 査読あり
• [雑誌論文] Lessons learned from an outbreak of COVID-19 in the head and neck surgery ward of a Japanese cancer center during the sixth wave by Omicron. (2022)
  • 著者名/発表者名: Naoya Itoh, Nana Akazawa, Masahiro Ishikane, Takanori Kawabata, Daichi Kawamura, Tomoyuki Chikusa, Eiichi N Kodama, Norio Ohmagari.
  • 雑誌名: Journal of Infection and Chemotherapy 巻: 28 ページ: 1610-1615
  • DOI: 10.1016/j.jiac.2022.08.010.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Surveillance and risk assessment of health screening for vaccine-preventable diseases among international students in Japan: A cross-sectional study in 2020 (2022)
  • 著者名/発表者名: Hanako Takahata, Kazunari Onishi, Hidetoshi Nomoto, Noriko Iwamoto,Kuniyoshi Hayashi, Narumi Hori, Satoshi Kutsuna, Eiichi N. Kodama, Norio Ohmagari.
  • 雑誌名: Human Vaccines & Immunotherapeutics 巻: 18 ページ: 2136914
  • DOI: 10.1080/21645515.2022.2136914.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impact of the COVID-19 pandemic on racial and ethnic minorities in Japan. (2022)
  • 著者名/発表者名: Hidetoshi Nomoto, Yusuke Asai, Kayoko Hayakawa, Nobuaki Matsunaga, Satoshi Kutsuna, Eiichi N. Kodama, Norio Ohmagari.
  • 雑誌名: Epidemiology and Infection 巻: 150 ページ: e202
  • DOI: 10.1017/S0950268822001674.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 麻疹ウイルス膜融合阻害ペプチドの構造最適化研究 (2022)
  • 著者名/発表者名: 山口夕貴, 髙原葵, 青木啓輔, 中津亨, 平田和成, 鈴木聡志, 林宏典, 河治久実, 井貫晋輔, 大野浩章, 加藤博章, 村山和隆, 児玉栄一, 大石真也
  • 学会等名: 第39回メディシナルケミストリーシンポジウム