| 研究課題/領域番号 |
21K19370
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
川口 寧 東京大学, 医科学研究所, 教授 (60292984)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2023-03-31
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| キーワード | セリン・スレオニンキナーゼ / Ser/Thr選択性 / HSV / リン酸化 |
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| 研究実績の概要 |
細胞機能の90%以上を制御するプロテインキナーゼ(PK)は、基質の特定の標的アミノ酸をリン酸化修飾する。一般的に、セリン・スレオニンPKのみが２種類のアミノ酸をリン酸化する。標的アミノ酸の選択性(Ser/Thr選択性)に関しては、(i) セリン・スレオニンPKは、セリンをリン酸化しやすいセリン選択型PK、スレオニンをリン酸化しやすいスレオニン選択型PK、セリンとスレオニンのリン酸化効率が同程度の非選択型PKに分類されること、(ii) 本分類はPKの活性中心近傍のアミノ酸側鎖によって決定されることが報告されている。しかしながら、これらのSer/Thr選択性は、各PK固有の性質であり、可逆的にSer/Thr選択性が変化するという制御機構の報告は皆無であった。最近、申請者らは単純ヘルペスウイルス(HSV)がコードするPKは、特定部位のリン酸化により、Ser/Thr選択性が変化するというユニークな予備的な知見を見出した。そこで、本申請課題では、HSV PKリン酸化の生物学的意義の解明というウイルス学研究を突破口に、細胞由来PKにおける同様の生命現象を紐解くことで、「セリン・スレオニンPKが２種類のアミノ酸を標的とする」という生物の基本原理に潜む、セリン・スレオニンPKの全く新しい生物学的意義の解明を目標とする。本年度は、まず予備的知見として得られたHSV PKリン酸化によるSer/Thr選択性のスイッチング・データの再現性と本リン酸化を阻害および恒常的模倣された遺伝子組換えウイルスの作出・性状解析を試みることとした。その結果、精製HSV PKを用いた試験管内リン酸化反応系・感染細胞レベルでのリン酸化状態の解析のいずれにおいても、予備的知見の再現性が得られた。さらに、作出した組換えウイルスを用いた培養細胞レベルにおけるHSV PK機能の各種解析を完了した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、HSV PKリン酸化によるSer/Thr選択性のスイッチングの再現性確認と本リン酸化を阻害および恒常的模倣された遺伝子組換えウイルスの作出・性状解析を完了した。具体的には、(i) HSV PKにStrep-tagを融合させた組換えHSVを作出し、感染細胞よりHSV PKを簡便かつ敏速に精製するシステムを構築し、試験管内リン酸化反応系(in vitro kinase assay)を用いて解析対象のリン酸化部位の阻害(フェニルアラニン置換)および恒常的模倣(グルタミン酸置換)によるHSV PK基質のリン酸化レベルを測定した。(ii) HSV PKの解析対象のリン酸化部位をフェニルアラニンおよびグルタミン酸置換した組換えウイルスを用いて、感染細胞レベルでの基質リン酸化の解析も実施した。さらに、HSV PK基質のリン酸化部位であるスレオニンをセリンに置換した組換えウイルスを作出することで、同一基質上のアミノ酸の差異(スレオニン or セリン)により、表現系が決定されているか否かも、in vitro kinase assayおよび感染細胞レベルにおけるリン酸化抗体解析を実施した。(iii) (ii)で作出した遺伝子組換えウイルスの培養細胞系における性状解析より、HSV PKのスレオニン・リン酸化効率の低下は、培養細胞系で観察されるHSV PKの代表的な機能の一部のみに有意な影響を与え、大部分のHSV PK機能は維持されるという知見も得た。以上より、本研究は、おおむね順調に進展しているが、本年度は、生体レベルにおける解析には着手できなかったことから、来年度は早急に病原性解析をスタートする予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画通り、来年度は、HSV PKリン酸化によるセリン・スレオニン選択性のスイッチング機構に関するin depth解析の継続、および、宿主PKへの水平展開を試みる。
先ず、昨年度、作出したSer/Thr選択性を阻害・恒常的に模倣した組換えHSVの生体レベルでの解析として、以下を実施する。(i) HSV PK Ser/Thr選択性を阻害した組換えHSV(HSV PK mutant)を脳内接種したマウスの生存率と脳内におけるウイルス増殖を解析することで、HSV PK Ser/Thr選択性のHSV神経病原性への影響を解明する。(ii) HSV PK mutantを角膜接種したマウスの末梢組織における病態発現、各標的組織(眼球、三叉神経節、脳)におけるウイルス増殖とマウスの生存率を解析することで、マウスの末梢組織における病態発現と神経侵襲能に対するHSV PK Ser/Thr選択性の影響を解明する。(iii) HSV PK mutantを角膜接種した6週後のマウスの三叉神経節に潜伏感染しているHSVゲノム・コピー数をQ-PCRにより解析することで、HSV PK Ser/Thr選択性の潜伏感染効率への影響を解明する。(iv) HSV PK mutantを角膜接種した6週後のマウス由来の三叉神経節を摘出し、物理的刺激によるHSV再活性化を上皮系細胞におけるプラーク形成を指標にモニタリングすることで、HSV PK Ser/Thr選択性の再活性化効率を解明する。以上、(i)~(iv)の解析により、HSV PK Ser/Thr選択性のHSV生活環における生物学的意義を徹底解明する。
さらに、HSV PKの当該制御部位と相同性を有する宿主PKでも、同様のSer/Thr選択性のスイッチング機構が保存されているのか否かも解析する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度、HSV PKのSer/Thr選択性が、HSV PKの多様な機能に及ぼす影響の全体像を解析する予定であった。そのため、多様な解析手法を遂行する必要があり、外部機関に所属する共同研究者との円滑な共同研究が必須であった。しかしながら、コロナウイルス感染拡大のため、タイムリーな共同研究は実施不能となってしまい、生体レベルにおける解析には着手できず、次年度使用額が生じた。
そこで、次年度に繰り越されたウイルス感染動物実験のため、実験動物(0.2万円/匹 x 300匹=60万円)、所属機関動物センターのケージサービスによるマウスの維持費(10万円/月 x 4月=40万円)、培地試薬(0.1万円/個 x 200個=20万円)、牛胎児血清牛(3万円/個 x 20個=60万円)、一般試薬(0.5万円/個 x 30個=15万円)、酵素類(1万円/個 x 5個=5万円)、プラスチック器具(0.1万円/個 x 280個=28万円)、キット(3万円/個 x 1個=3万円)、合計約231万円が必要である。
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