| 研究課題/領域番号 |
21K19378
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
堀口 安彦 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (00183939)
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| 研究分担者 |
西田 隆司 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (20845200)
平松 征洋 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (90739210)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| キーワード | 百日咳菌 / 二成分制御系 / BvgAS |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、既存の抗生物質によらない百日咳菌(Bordetella pertussis)の感染制御方法を探索および確立することにある。本研究計画では、百日咳菌の病原性が単一のマスターレギュレーター(BvgAS系)によってコントロールされていることに着目し、これをオフにする化合物を探索して使用することによって 菌を非病原性化し、結果として感染制御する方法の確立を目指した。
最初に、化合物のスクリーニングに用いるアッセイ系の構築をおこなった。先行研究により、Bvg-相の百日咳菌が発現すると考えられる遺伝子24種類を選択し、先行研究の報告どおりに発現が制御されるのかどうかリアルタイムPCR法で検討した。そこで有力な遺伝子をさらに絞りこみ、またアッセイに最適な百日咳菌の培養方法も検討した。その結果、Bvg-相特異的な遺伝子を2種、BvgASが 活性化した状態(Bvg+相)で発現する遺伝子を2種選択し、それらのプロモーター活性を評価するレポーター百日咳菌を作製した。また、Bvg+相およびBvg-相で再現よくレポーター遺伝子(gfp)の発現を確認するためには、百日咳菌をボルデジャング寒天培地で培養する方法が最適であることを見出した。 上記のようにして確立したアッセイ系を用いて、1,134種類の化合物ライブラリーをスクリーニングした。その結果、5種の化合物が百日咳菌をBvg-相に誘導して非病原性化する有力な化合物候補として選択することができた。
初年度に見出した5種の化合物が、静菌あるいは殺菌作用を発揮しない低濃度で百日咳菌をBvg-相に誘導することができるかどうか検討したところ、これらの条件を満たす化合物1種を選択することができた。これをXと仮称する。本研究計画期間を延長し、現在Xを用いた動物感染実験を進めているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
目的の化合物を探索するためのスクリーニングの指標に用いるBvg-相に特異的な遺伝子の決定と一次スクリーニングは計画通りに進めることができたが、その後、選択した5種の化合物の性状解析と絞り込み（二次スクリーニング）に想定よりも長い期間を要したため、予定の期間内に、最終的な目標であった動物感染実験における候補化合物の効果を検討することができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
想定よりも時間を要したが、これまでに候補化合物のin vitroでの効果は充分に確認できた。研究の延長期間には、動物感染実験における該当化合物の効果を検討する。このため、菌の感染ルート、化合物の投与方法および投与時期を予備実験にて決定し、計画に沿って実験を実施する予定である。本研究の遂行において、予想される問題点は今のところ見当たらないため、特段の計画の変更を経ずに実験が実施できると考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
有用化合物の一次スクリーニングと、一次スクリーニング後の候補化合物の性状解析と絞り込み（二次スクリーニング）に想定以上の時日を要したため、本研究計画で最後に予定していた感染動物を用いた化合物の効果の評価が実施できなかった。そこで翌年度は、残された百日咳菌の感染動物モデル実験を行う。この目的のため、百日咳菌の投与菌数、化合物の投与ルートおよび投与時期などを予備実験で検討してプロトコールを確立し、最終的に化合物の有用性を評価する予定である。
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