| 研究課題/領域番号 |
21K19564
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| 研究機関 | 地方独立行政法人神戸市民病院機構神戸市立医療センター中央市民病院(第1診療部、第2診療部、第3診療部 |
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研究代表者 |
山本 典生 地方独立行政法人神戸市民病院機構神戸市立医療センター中央市民病院(第1診療部、第2診療部、第3診療部, 中央市民病院, 部長 (70378644)
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| 研究分担者 |
池川 雅哉 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (60381943)
中川 隆之 京都大学, 医学研究科, 研究員 (50335270)
大西 弘恵 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (50397634)
岡野 高之 京都大学, 医学研究科, 講師 (60642931)
十名 洋介 京都大学, 医学研究科, 助教 (80898073)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| キーワード | タンパク質 / 網羅的発現解析 / 蝸牛 |
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| 研究実績の概要 |
本年度は昨年度から引き続き、IMS用の標本作成方法の検討を行った。切片に関しては前年度までに、骨に囲まれた成体マウス蝸牛の切片を未固定、未脱灰で作成できるようになっており、蝸牛内の血管条、コルチ器、ライスネル膜などを切片上で同定することができるまでになっていた。本年は、この手法で作成した切片を用いて、laser micro dissection (LMD)を用いて、蝸牛切片内のさまざまな部位から網羅的なタンパク質同定（ショットガンプロテオミクス）用のサンプルを回収するプロトコールの作成を行った。その結果、野生型成体マウス蝸牛の有毛細胞などが含まれるコルチ器、血管条、蝸牛神経からサンプルを回収することが可能で、各サンプルを10ショットあるいは30ショットから回収して解析を行うこととした。一方、Whole mountの蝸牛サンプルを用いたLMDも試みたが、十分な試料を得ることができなかった。次に、加齢性感音難聴の蝸牛各部位からの網羅的タンパク質同定を行うため、C57BL/6Jマウスの6週齢（若年、正常聴力）、6か月齢（中年、高音中心の難聴）、12か月齢（高齢、聾）の蝸牛切片の準備を行った。さらに、加齢性難聴以外の感音難聴のモデル動物として、マウスの音響外傷モデル作成プロトコールの策定を行った。音響外傷用のスピーカーの配置方法、呈示する音響の周波数、音圧、呈示音響のモニタリング方法などを検討した。その結果、呈示音響を常にモニタリングしながら、呈示音圧の低下がある場合には音圧を調整しながら、110dBの音圧で、8～16 kHzのオクターブバンドノイズで2時間暴露する条件が、最も安定してtransient threshold shiftのモデルマウスを作成することが可能になった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究の目的は発生期マウス蝸牛及び感音難聴モデルマウス蝸牛を用いたイメージング質量分析（IMS）を含む質量分析の手法の確立を行い、蝸牛の発生および感音難聴の病態に重要な役割をはたすタンパク質や糖脂質を解明し、その成果を新規感音難聴治療法の開発につなげることである。本年度は、網羅的なタンパク質発現解析であるショットガンプロテオミクスを行うために、昨年度確立した未脱灰・未固定の成体マウス蝸牛切片からLMDにより蝸牛内の特定の部位から解析試料を回収するプロトコールの策定を行った。また、代表的な感音難聴の動物モデルとして、加齢性難聴および音響外傷の２つのモデルを採用することとした。前者は、各年齢に達したマウスの蝸牛を取り出して切片を作成するのみであるが、後者は音響暴露の条件検討が必要で、今年度は京大の医学研究科動物実験室内の音響実験室での音響暴露の条件を設定することに成功した。また、計画書に記載した内耳性難聴モデル遺伝子改変マウスであるGomafuノックアウトマウス、シアル酸合成酵素 KOマウスの入手、生育も進んでいる。このように、本研究で施行する研究の試料の調整は順調に進み、切片を用いたショットガン解析やIMS、どちらの解析も可能な状態になっている。一方、解析機器については、池川研究室のIMS用の機器が故障し2022年度は使用不可能であったため、実際の解析は行えていない。ショットガン解析については、サンプルの反応を順次進めているところである。総合すると、サンプルの解析が十分に進んでいない点で、研究の進捗はやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和5年度は令和4年度に十分に確立された調整法に基づいて準備した試料を用いてIMSやショットガンプロテオミクスを進めていく予定である。具体的には今回、サンプリング方法が確立した様々な部位（コルチ器、血管条、蝸牛神経）の試料を用いて、ショットガンプロテオミクスを行い、各部位に検出されたシグナルのピークに該当するタンパク質の発現プロファイルを用いて、次元削減、教師なしクラスタリングを行い、タンパク発現プロファイルに基づき、各部位に特異的なタンパク質や糖脂質、脂質を同定して、その局在を正常マウスの切片であらためて確認し、最終的にはその機能の検定まで行っていきたい。さらに、感音難聴のモデルとして、すでにサンプルの調整が可能な加齢性難聴と音響外傷の蝸牛についてのショットガンプロテオミクス、IMS解析も進めていく。正常蝸牛とのタンパク質などの発現の違いを検証することによって、加齢性難聴や音響外傷のメカニズムに重要な役割を果たす分子の同定が期待できる。感音難聴モデルの解析については、抗がん剤であるシスプラチンや抗菌薬であるアミノグリコシドの投与による薬剤性感音難聴モデルについてもその確立を行ったうえで、ショットガンプロテオミクス、IMSを行う予定で、それにより、加齢性難聴や音響外傷と同様の検証を行うことができる。また、薬剤性感音難聴モデルの場合は、該当薬剤の局在もIMSで判定することができるため、これまでほとんど研究されてこなかった蝸牛内の薬物動態についての検証も行えると考える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年に続き、新型コロナウイルス感染拡大のため、共同研究者との共同作業を十分に進めることができず、また、機器の故障もあり次年度使用額が生じた。来年度は、今年度十分に施行することができなかったIMSやショットガン解析に次年度繰り越しの予算を使用する予定である。
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