| 研究課題/領域番号 |
21K19690
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
前島 洋 北海道大学, 保健科学研究院, 教授 (60314746)
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| 研究分担者 |
真先 敏弘 帝京科学大学, 医学教育センター, 教授 (00585028)
高松 泰行 北海道大学, 保健科学研究院, 助教 (40802096)
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| 研究期間 (年度) |
2021-07-09 – 2024-03-31
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| キーワード | リハビリテーション / 再生医学 / エピジェネテイクス / 脳卒中 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、遺伝子発現の調整機構として可塑的遺伝子発現の促進が期待されるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（HDAC）の投与により可塑的脳内環境を提供し、中枢神経軸索再生に際して軸索伸長阻害因子を発現するオリゴデンドロサイトに代わり末梢神経由来シュワン細胞を損傷域に移植し、エピジェネテイクス制御下における軸索再生と機能回復効果を検証することであった。この目的のため初年度は、ヒストンアセチル化酵素阻害剤（HDAC）投与による脳内BDNF発現の影響について生体脳イメージングを用いて検証実験を進めるとともに、移植用細胞の培養法の確立、準備を進めた。HDAC投与による生体脳内におけるBDNFの発現を検証するため、BDNFのプロモーター域に蛍発光酵素Luciferase遺伝子を挿入したBDNF-Luc Tgマウスを繁殖、飼育し、このTgマウスを対象にHDAC阻害剤（NaB, 1200mg/kg）と脳深部の発光の検知を可能とする発光基質を腹腔内投与後、脳領域の発光を経時的に測定した。投与後１時間における生体脳イメージングにおいて、複数のマウスにおいてNaB投与時において生理的食塩水投与時と比較して脳領域のBDNF発現を示す発光強度の増加を示唆する予備的所見を得た。また、移植細胞の準備として、ラットシュワン細胞をCell lineより導入し、同細胞培養に適した培養条件を確立し、安定的に継代培養、凍結保存を進めた。併せて、BSL2、P2レベル実験の実験環境を整備し、次年度におけるレンチウィルスベクターを用いたマーカー蛋白であるGFP遺伝子導入への準備を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初予定においてシュワン細胞の単離とGFP遺伝子導入を含む移植用細胞の作成は研究分担者の施設で実施する予定で計画されていたが、諸事情により研究代表者の施設で実施することに変更された。このため、研究代表者の施設におけるレンチウィルスベクターを用いたGFP遺伝子導入に際して、BSL2実験室としての環境整備と認可、更にBSL2、P2レベル実験計画の認可に時間を要した。併せて、実験室環境の制限から使用する細胞をprimary cultureからcell lineによる導入に変更する必要が生じたため、対応に時間を要した。以上の実験環境に起因する問題点は当該年度において解決され、安定的な細胞培養に至ったことから、次年度においてはシュワン細胞へのGFP遺伝子導入を用いた移植用細胞の作製への着手が予定されている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は以下３項目について研究を推進する
１．移植細胞の作成：前年度においてウィルスベクターを用いたBSL2, P2レベル実験環境が整備され、安定したシュワン細胞培養が可能となったことを受け、移植用細胞の完成とその培養を進める。レンチウィルスベクターを用いたGFP蛍光能、Hygromycin耐性能の遺伝子導入を行う。Hygromycin溶液を完全培地において遺伝子導入細胞の複数回のselection、cloning等を進めてGFP蛍光能付与シュワン細胞の培養を進め、これを移植用細胞として継代、凍結保存する。また、ヒストンアセチル化酵素阻害剤（HDAC）がシュワン細胞における遺伝子発現、分化に与える影響を精査するため、培養シュワン細胞を対象とするHDAC投与の影響に関するin vitro実験を並行して進める。
２．脳出血モデルラットの作成：脳出血モデルの作成は、深麻酔下状態にてマイクロインジェクションポンプを用いて損傷側線条体、内包域に血管基底膜を破壊する酵素であるcollagenaseを微量注入することにより作成する（ICHモデル）。
３．シュワン細胞の移植とその効果検証：ICHモデル作成後、GFP蛍光付与したシュワン細胞を脳出血モデル作成と同様にステレオタキシックシステムにより脳損傷領域に注入移植し（同種移植）、行動評価を通して機能回復への影響を精査した後、脳における移植細胞の定着と機能化についてGFPをマーカーとする組織化学的分析、生化学的分析を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度計画していた遺伝子導入実験の実験環境（BSL2）の整備に時間を要し、BSL2レベルの遺伝子導入実験を次年度に持ち越したため。
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