研究課題
本研究の目的は、クロマチンリモデリング因子DDM1を含む複合体を同定し、生化学・分子遺伝学的解析によってDDM1複合体のトランスポゾン認識機構およびトランスポゾン鎮静化の分子機構を明らかにすることである。研究代表者によるこれまでの研究により、抑制的なエピゲノム修飾の維持に重要なクロマチンリモデリング因子DDM1がヒストンバリアントH2A.Wをペリセントロメアに運び、トランスポゾンの発現を抑制するという新規機構が見出された。しかし、DDM1によるトランスポゾン標的機構およびH2A.W取り込み機構は未解明のままである。クロマチンリモデリング因子は一般的に他のタンパク質群と複合体を形成することでそれぞれ特異的なクロマチン領域で機能を発揮することが報告されていることから、DDM1相互作用因子がDDM1の機能・領域特異性を生み出していると予想された。そこで本研究では、生化学的なアプローチによりDDM1と相互作用する因子群を同定し、試験管内再構成系を用いた生化学的解析やシロイヌナズナ個体を用いた分子遺伝学的解析によって本研究課題の解明を目指している。これまでに、独自に作製したDDM1抗体を用いて、シロイヌナズナ由来の培養細胞から調製した抽出液からDDM1を含む複合体を単離・精製し、質量分析によってDDM1相互作用因子の探索を行なった。その結果、機能未知のタンパク質やクロマチン結合因子がDDM1相互作用因子の候補として得られた。得られたDDM1相互作用候補因子について、DDM1機能欠損と同様の表現型を示すかを検証するために、パブリックリソースから入手したT-DNA挿入変異体の生育を現在進めている。並行して、近接依存的標識法によってDDM1複合体を同定するために、改変型ビオチンリガーゼTurboIDもしくはminiTurbo融合DDM1発現植物体の作出を進めている。
2: おおむね順調に進展している
本研究において、DDM1抗体を用いた免疫沈降法によって、シロイヌナズナ由来の培養細胞からDDM1相互作用因子の探索を行なった。質量分析による解析から、これまでにDDM1との相互作用が報告されていないクロマチン結合因子や機能未知のタンパク質がDDM1相互作用因子の候補として得られたことから、DDM1はこれまで報告されているクロマチンリモデリング因子とは異なる新規の複合体を形成することが示唆された。これらのDDM1相互作用候補因子のT-DNA挿入型変異植物由来の種子を入手し、これまでに数十系統の変異植物の取得を確認している。今後、得られた変異植物のエピゲノム状態がDDM1機能喪失植物体と同様であるかをゲノムワイドに解析することで、DDM1との遺伝学的な相互作用が明らかになると期待できる。また、DDM1のトランスポゾン認識機構は一過的であることが予想されるため、ビオチンリガーゼを用いた近接依存的標識法によるDDM1相互作用因子の探索を進めている。これまでに、作製したコンストラクトが導入されている形質転換体の選抜を実施しており、次年度には解析が可能な状況になると予想される。並行して、生化学実験に必要な、特定のエピゲノム修飾やヒストンバリアントを含むヌクレオソームの試験管内再構成を順次進めている。以上より、本研究課題は当初の予定通り、順調に進展していると考える。
本研究により、これまでにDDM1相互作用因子の探索とそのT-DNA挿入変異型植物体の取得に至っている。現在、候補因子の変異植物体の生育を進めている。今後は、得られた変異植物のエピゲノムの変化がDDM1機能喪失植物体と同様であるかをゲノムワイドに解析するとともに、さまざまな変異植物との交配を通して、抑制型エピゲノム修飾の維持やトランスポゾン鎮静化におけるDDM1相互作用因子の機能を遺伝学的に解析する。また、これまでに実施したDDM1抗体による免疫沈降に加えて、エピトープタグを利用した免疫沈降およびビオチンリガーゼ融合DDM1発現植物体を用いた近接依存的標識を実施する。これらの異なるアプローチから得られる結果を統合して、DDM1相互作用因子群の同定を試みる。さらに、得られたDDM1相互作用候補因子をリコンビナントタンパク質として発現・精製する系を確立し、DDM1または特定のエピゲノム修飾やヒストンバリアントを含む再構成ヌクレオソームとの相互作用を生化学的に解析する。以上の解析を通して、DDM1を含むクロマチンリモデリング複合体のトランスポゾン標的機構とトランスポゾン鎮静化の分子機構解明を目指す。
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Nature Cell Biology
巻: 23 ページ: 391～400
10.1038/s41556-021-00658-1
http://www.bs.s.u-tokyo.ac.jp/~iden/
