研究課題
球脊髄性筋萎縮症（SBMA）は成人男性のみに発症する進行性の遺伝性神経筋疾患である。本研究課題では、シングルセル解析を用いてSBMAマウスモデル（AR-97Q）の脊髄における1細胞ごとの遺伝子発現情報を発症前から経時的（3、6、9、13週齢）に取得し、SBMAの早期病態解明と治療開発を目指す。令和３年度は、まずSBMAマウスモデルの凍結脊髄からシングル核を抽出するプロトコルを確立した。10xGenomicsが推奨しているFrankenstein protocolを採用した。脊髄はミエリンなどのデブリスが多く含まれるため、Debris Removal Solution (Miltenyi Biotec)を用いた精製を追加することによりFACSで多くの核を特異的に回収できるようになった。シングルセル解析の細胞調整では、RNAの質を保つために複数サンプルの核抽出を素早く行う必要があり、FACSでのソートが１サンプルあたり10分程度で行えるよう条件検討を行った。また練習用のサンプルを用いてFACSで回収した約10000個の核からRNAを抽出し、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドログリア、ミクログリアなど主要細胞群のマーカーをqPCRで検出し、RNAが保たれていることを確認した。その上でまず進行期である13週齢の野生型マウスとAR-97QマウスのシングルセルRNA-seqを行った。各細胞群が主要マーカーを用いてクラスタリング可能であることを確認した後、発症前の３週齢、発症直前の６週齢、発症前期の９週齢の野生型マウスとAR-97QマウスのシングルセルRNA-seqを行った。これらの結果をLoupe cell browserや統計ソフトR（Seurat）を用い、解析を行った。
2: おおむね順調に進展している
申請者はROSAnT-nG mouseを購入し、ChAT-Cre mouseと共に維持している。それらを交配し、Creが不在の細胞では核に限局した赤い蛍光（tdTomato）、Cre存在下では核に限局した緑の蛍光（GFP）を有するChAT-Cre nuclear reporter mouseを作成した。今後このマウスの脊髄から各細胞核をFACSによりソートできるかどうか確認する。令和3年度は、SBMAマウスモデルと野生型マウスの各週齢（発症前、発症直前、発症前期、進行期）の凍結脊髄からシングル核を回収した。その後、10×Genomics社のChromium システムを用いてライブラリを作成し、シングルセルRNAシーケンスを行った。1細胞あたりのリード数は10X推奨の2万リード以上であることを確認した。また、transcriptomeへのmapping率は70％以上であった。合計約7万個の核のデータを取得し、Loupe cell browserや統計ソフトR（Seurat）を用いてQuality Controlの後、クラスタリング、発現変動遺伝子抽出、細胞種同定を行った。現在は発症前期のデータに注目し、各細胞種のサブクラスタリングを行った後、GO解析やKEGGエンリッチメント解析を行い、SBMAマウスモデルと野生型の特徴づけを行っている。上記の内容は研究計画のとおりであり、おおむね順調に進展していると考えている。
SBMAマウスモデル発症前期のデータ解析が終了した後、発症前、発症直前、進行期のデータ解析を同様に行い、各細胞種の変化が他の週齢と共通しているかどうか、いつから顕在化しどのように推移しているか解明する。またサブクラスタリングによる細胞間の多様性解析、Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）、擬似時系列解析などの時空間解析を行い、AR-97Qマウスにおけるシグナル変化、特に発症前に変化が大きいパスウェイや遺伝子、細胞種に注目する。その後、注目した遺伝子に関してマウス組織の免疫染色による検証を行う。またSBMA患者の剖検サンプルを用いてSBMAモデルマウスとの共通性を確認する。マウス組織とヒト組織で検証された複数の遺伝子について、マウスの初代培養に対してCRISPR-Cas9/dCas9システム等を用いて過剰発現もしくは発現抑制を行い、細胞のviability（WST-8アッセイ）や毒性（LDHアッセイ）の変化を解析して病態への関与を解明する。さらに可能であればSBMAマウスモデルを用いて検証を行う。ニューロンに関する変化は、ChAT-Cre nuclear reporter mouseとSBMAマウスモデルを交配して作成予定であるChAT-Cre nuclear reporter SBMA (NR-SBMA)マウスのシングルセル解析を行い、上記と同様に解析を進めていく。
すべて 2021
すべて 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 1件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 3件)
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