| 研究課題/領域番号 |
21K21247
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
佐藤 葵 新潟大学, 医学部, 技術補佐員 (10808752)
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| 研究期間 (年度) |
2021-08-30 – 2024-03-31
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| キーワード | Phos-tag対角線電気泳動法 / 生活習慣病 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではタンパク質の機能的なリン酸化状態を検出及び同定することができる新技術、Phos-tag対角線電気泳動法を利用して肥満や糖尿病といった生活習慣病に係るタンパク質のリン酸化状態に着目した病態解明を目的としている。
本年はリン酸化状態の異なるサンプルを用いて、前年に試行した、Phos-tag対角線電気泳動後にPVDF膜へ転写、抗原抗体反応による特定のタンパク質を検出する方法を用いて検討した。すると、核と細胞質分画、MAPKの阻害剤であるU0126添加によりFoxM1の泳動パターンに変化が見られた。しかしながら、Phos-tag対角線電気泳動の一次元目と二次元目で検出されるバンドのパターンに乖離がみられるなどの問題が発生した。一次元目と二次元目で検出されるバンドのパターンに乖離については、タンパク質の抽出方法により影響を受けることが明らかになった。
Phos-tag対角線電気泳動によりリン酸化状態の異なるタンパク質スポットを特定後にそのスポットを質量分析計で測定を行う予定であり、質量分析計にかけるためのサンプル調整方法や機器操作、解析方法を現在習得中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Phos-tag対角線電気泳動後にPVDF膜への転写は行えるようになったが、再現性に問題が生じている。また、Phos-tag対角線電気泳動の一次元目と二次元目で検出されるバンドのパターンに乖離がみられ、転写効率や抗原抗体反応に影響を与えている可能性がある。
また、所属先の変更により研究環境が変化しセットアップに時間を要したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究に必要な道具・試薬等は揃いつつあるので、新環境でもPhos-tag対角線電気泳動を行っていく。
今後はPhos-tag対角線電気泳動により、リン酸化状態の異なるスポットをCBB染色や銀染色で検出できるように免疫沈降によるサンプルの濃縮を行う。また、FoxM1にこだわらず肥満や糖尿病などの病態により変化するリン酸化状態の異なるタンパク質をPhos-tag対角線電気泳動と質量分析の両方を組み合わせて網羅的に解析を行っていく。
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