| 研究課題/領域番号 |
21KK0128
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| 研究機関 | 福井県立大学 |
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研究代表者 |
風間 裕介 福井県立大学, 生物資源学部, 教授 (80442945)
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| 研究分担者 |
西嶋 遼 福井県立大学, 生物資源学部, 助教 (00841561)
大谷 真広 新潟大学, 自然科学系, 助教 (30768841)
水多 陽子 名古屋大学, 高等研究院(WPI), 特任助教 (70645142)
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| 研究期間 (年度) |
2021-10-07 – 2025-03-31
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| キーワード | 性染色体 / 雌雄異株植物 / ヒロハノマンテマ / 性決定 |
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| 研究実績の概要 |
ナデシコ科雌雄異株植物ヒロハノマンテマ(Silene latifolia)のＹ染色体のほとんどはX染色体と組換えを起こさずに変異を蓄積し、X染色体の1.5倍(570 Mb)に巨大化している。これは、キウイフルーツなどのXY染色体が同じサイズである性染色体よりも分化が進んだ状態といえる。我々は、このY染色体上に存在する性決定遺伝子候補であり、めしべの発達を抑制すると考えられる遺伝子(GSFY)を同定し、そのパラログがX染色体上にも存在する（GSFXがある）ことを明らかにした。GSFXはRNA-seqのデータからも検出されたため、発現していると考えられる。本研究では、両遺伝子について、分子生物学的な遺伝子機能解析と進化遺伝学解析を行い、どのような突然変異が生じて性決定遺伝子が誕生したのかを明らかにする。
本年度は、GSFY遺伝子およびGSFX遺伝子の発現解析を実施し、どちらも茎頂で発現しているが、GSFYは発達初期の雄の花芽でも発現していることを確認した。
アミノ酸配列の相同性比較からは、GSFX遺伝子は機能喪失していることが推定された。機能喪失している遺伝子は、選択圧が無くなるため他の遺伝子よりも集団内での変異蓄積頻度が高いはずである。そのため、Oxford大と連携し、野生種を収集して変異頻度を調査することとした。本年度は、来年度の渡英しサンプル収集を行う段取りを行った。
また、両遺伝子の機能解析用のコンストラクションを行うため、nativeプロモーターの配列決定を行ったほか、35Sプロモーター直下にそれぞれのCDS配列を連結したコンストラクトを作製した。形質転換系の構築に向け、カルス誘導法の検討、茎頂へのガラスキャピラリーを用いたアグロバクテリウム感染法等などの検討を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
両遺伝子の発現解析を行い、野生種の収集計画、コンストラクションを順調に進めている。in situ hybridizationの実験系の構築も進めており、組織の固定法、包埋法、切片の作製法を一通り整えた。プローブの作製、ハイブリダイゼーション、シグナル検出については、旧来の方法を試したが、花器官発達に関わるClass B遺伝子の発現を確認できたものの、当該遺伝子の発現量がとても少なく、明瞭なシグナル検出には至らなかった。今後、Biotinylated tyramide法や、RNAscope法等のシグナル増感方法を試す。
形質転換系の開発については、花粉へのボンバードメント法、茎頂へのボンバードメント法、茎頂へのガラスキャピラリーを用いたアグロバクテリウム感染法等を進めてきた。花粉へのボンバードメント、および茎頂へのガラスキャピラリーを用いたアグロバクテリウム感染法ではGFPの一過的発現には成功したが、ゲノムへの組み込みは成功に至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）ヒロハノマンテマとその近縁種の遺伝資源の整備:風間と大谷あるいは西嶋が、同研究者であるFilatovと供に英国内に自生するヒロハノマンテマとその近縁種を採集する。培養個体は胚珠培養により獲得する予定であるが、採集時に花が観察できない場合、葉または節の組織を培養する。性別は、葉からDNAを簡易抽出しY染色体特異的マーカーでPCR を行い判別する。培地上で再生された個体は順次鉢へ植え替え、温室にて栽培する。ヒロハノマンテマについては、GSFX遺伝子およびGSFY遺伝子のシーケンスをサンガー法にて調査する。他の近縁種については、RNA-seqを行い、高品質ゲノムの参照配列にマップしGSFY およびGSFXの始原遺伝子を得る。
２）性決定遺伝子GSFYとX染色体連鎖パラログGSFXの機能解明 :GSFYとGSFXの遺伝子発現領域をin situハイブリダイゼーションにより確認する。また、形質転換系が確立されており、花器官の形態がヒロハノマンテマと類似しているナデシコ（Dianthus hybrida)に対して、両遺伝子の形質転換を行い、GSFXおよびGSFY遺伝子の機能を調査する。
引き続き、形質転換法の開発を続ける。上記に加え、花芽にキャピラリーでアグロバクテリウムを感染する方法や、陰圧下で茎頂や花芽にアグロを感染させる方法を試す。また、１）で収集したヒロハノマンテマの野生系統をカルス誘導してアグロバクテリウムを感染させ、より感染しやすい系統を選抜する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
近縁種のRNA-seqを行い、祖先GSFY遺伝子の探索を行う事としたため、次年度に繰り越した。次年度は、英国で採種した近縁種のRNA-seqを行うために使用する。
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