| 研究課題/領域番号 |
21KK0129
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
酒井 則良 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 准教授 (50202081)
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| 研究分担者 |
菊地 真理子 名古屋大学, 理学研究科, 助教 (20845135)
河崎 敏広 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 助教 (30770630)
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| 研究期間 (年度) |
2021-10-07 – 2025-03-31
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| キーワード | 減数分裂 / ゼブラフィッシュ / メダカ / ライブイメージング |
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| 研究実績の概要 |
減数分裂では、特異的な染色体構造のダイナミックな動的変化とそれに伴う相同組換えの一連のプロセスが時間軸に沿って秩序立って起こる。その全体像を理解するためには、動的な変化の理解が不可欠であるが、脊椎動物ではまだ適当な実験系はない。本研究では、ゼブラフィッシュにおける減数分裂全過程をカバーする精子形成培養系、メダカにおける卵巣と精巣の組織培養系および遺伝子ノックイン技術と、ゼブラフィッシュにおける卵巣イメージング法を統合して、減数分裂特異的染色体構造の動的な変化を絶対時間軸に沿ってモニターできる新規ライブイメージング法を確立することを目的とする。
減数分裂期減数分裂期の染色体は特徴的な軸-ループ構造をとり、組換えの進行に伴って、相同染色体を物理的に繋ぐシナプシスを生む。そして、この構造を足場として一連の組換えタンパク質が秩序立って機能する。これらの染色体の軸、シナプシス形成と組換えのタンパク群の挙動をモニターするためには、個々のタンパク質に対する適切な蛍光標識技術と培養系によるそれらの高解像度イメージング技術が不可欠である。2021年度は、ゼブラフィッシュの得意技術である生殖細胞培養とメダカの得意技術である遺伝子ノックインについて技術交流を進め、ゼブラフィッシュではトランスジェニック技術、メダカでは生殖細胞培養技術の改良を進めた。合わせて、現状の培養系でのイメージングの解像度を知る目的でDNA染色試薬を用いた染色体構造のイメージングを行うとともに、解析に必要なノックアウト個体、トランスジェニック個体の作出を順次進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ゼブラフィッシュでは主にトランスジェニック作出技術の改良を進め、導入DNAの精製度等を上げることで効率が上がることを確認した。また、導入遺伝子の発現を誘導できるシステムとしてtet-onシステムを導入した。これにより、特異的なプロモーターを用いる必要がなくなり、任意の時期に蛍光標識したタンパクを発現させることが可能となった。メダカでは卵巣細胞と精巣細胞の初代培養系を確立した。メダカの生殖巣の解離条件を決定し、ガラスボトムディッシュで培養して染色体形態観察と免疫染色を併せることにより、共焦点顕微鏡下で第一減数分裂前期の細胞を特定することができた。精母細胞については、精母細胞が培養ディッシュに固着しないため安定的なトラッキングが困難であったため、メダカ精巣由来のMtp2細胞をフィーダーとして導入した。その結果、特定の精母細胞内の染色体動態をトラッキングしながら約15分間イメージングすることに成功した。
DNA染色試薬を用いた染色体構造のイメージングについては、ゼブラフィッシュの培養精原細胞をHoechst 33342で処理し、DeltaVision Ultraで観察したところ、十分なイメージング画像を得られることがわかった。一方、メダカ生殖細胞では、Hoechst 33342、SiR-Hoechst、Kakshine PC5を検討した結果、Kakshine PC5で長波長（647 nm）による励起で光毒性を抑えつつ明るいシグナルを得ることができた。
さらに、哺乳類培養細胞でp62遺伝子欠損株は遺伝子導入効率が上がることが報告されているため、ゼブラフィッシュでそのノックアウトを作出した。また、メダカではsycp3-EGFPトランスジェニックの生殖腺を用いて免疫組織化学をおこない、第一減数分裂前期染色体の軸構造がラベルされていることを確認した。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度の取組みにより、ゼブラフィッシュへのトランスジェニック作出とメダカ生殖細胞の培養系の基盤が整備されつつある。また、シナプトネマ構造の側方要素（染色体軸構造）のSycp3の蛍光標識ができたため、今後は、それ以外のシナプトネマ構造の対合要素のSycp1、Syce1、Syce2、Syce3、Tex12、減数分裂期コヒーシン（染色体軸構造）のSmc1β、Rec8a、Rec8b、Rad21l、Stag3、テロメア結合タンパク質群のTerf1、Terfa/2、Pot1、 Rap1、Tin2、Tpp1、Terb1の蛍光標識を順次、予定通り進める。コロナウイルス感染防止措置により、まだ国際共同研究者のThe Hebrew University of JerusalemのElkouby博士のところに訪問できていないが、規制が解除され次第、確立できたsycp3-EGFPトランスジェニック系統から順に持ち込んでイメージングを進め、イメージング法の改良を進める予定である。また、これらの減数分裂制御因子群の絶対時間軸における相互作用カスケードを正確に把握するためには、個々の因子の欠損株の観察も不可欠である。蛍光標識と並行して、ノックアウト個体の作出を進め、それを用いたライブイメージングも行いたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ感染防止措置により、国際共同研究者のThe Hebrew University of JerusalemのElkouby博士のところに訪問できていないため、主にその旅費を繰り越したため。状況を判断して、できるだけ早く訪問する計画である。
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