| 研究課題/領域番号 |
21KK0249
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| 研究機関 | 大阪公立大学 |
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研究代表者 |
森田 能次 大阪公立大学, 大学院農学研究科, 客員研究員 (40795308)
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| 研究期間 (年度) |
2022 – 2024
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| キーワード | 融合タンパク質 / 指向性進化法 / アルブミン |
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| 研究実績の概要 |
遺伝子組換え技術によって作られたタンパク質（組換えタンパク質）やペプチドはバイオ医薬品としてとして注目されている。しかし、血中半減期が短いものも多く、有効血液中濃度を維持するには頻回投与が必要となる場合が少なくない。これらの課題を克服する方策の一つが、「治療用融合タンパク質製剤の合成」である。なかでもヒト血清アルブミン（HSA）との融合は、生物学・免疫学的安全性および血中半減期の延長に絶大な効果を発揮する。基課題において、ヘモグロビンとHSAからなるタンパク質複合体を合成し、それが赤血球の酸素結合能を保持した人工酸素運搬体となることを実証した。さらに、HSAとの融合タンパク質の発現系を構築した。しかし、HSAと比べて発現量が低下し、理想的な製剤とするには、生産量の向上が鍵となる。そこで本国際共同研究では、基課題を大きく発展させ、指向性進化法を用いたアルブミン融合タンパク質の合理的な設計方法の開発を目指す。具体的には、分子動力学シミュレーションと指向性進化法により、分泌シグナルペプチドを最適化し、超高発現融合タンパク質の一群を合理的に設計・合成できる手法を確立することを目的とする。
本年度は、共同研究先に渡航し、海外共同研究者のグループにて、分泌シグナルペプチドおよびその変異体について、分子動力学シミュレーションを実施した。得られた結果から、分泌シグナルペプチドの分子内相互作用を解析することで、発現量に関与する分泌シグナルペプチドの領域を見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本国際共同研究では、指向性進化法を用いたアルブミン融合タンパク質の合理的な設計方法の開発を目指す。具体的には、分子動力学シミュレーションと指向性進化法により、分泌シグナルペプチドを最適化し、超高発現融合タンパク質の一群を合理的に設計・合成できる手法を確立することを目的とする。
本年度は、渡航前に分泌シグナルペプチドの分子モデルや計算方法について、綿密なディスカッションをオンラインで行った。ColabFoldを用いて、分泌シグナルペプチドの初期構造を予測した。共同研究先に渡航し、海外共同研究者のグループにて、分泌シグナルペプチドおよびその変異体について、分子動力学シミュレーションを実施した。分子内相互作用を解析するため、それぞれのステップにおいて、α炭素間の距離を求めたところ、発現量に関与するペプチドの領域が見出された。発現量向上のメカニズムについての理解が深まれば、合理的な分子設計を行うことが可能となる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、ピキア酵母を宿主とする発現系を構築し、発現量を評価する。具体的には、発現量に関与する領域に変異導入した分泌シグナルペプチドを設計する。N末端に分泌シグナルペプチドを導入したアルブミンの発現プラスミドDNAを調製する。また、潜在的に有益なアミノ酸位置を特定するために、ランダム変異導入により、網羅的に変異導入されたプラスミドDNAライブラリーも作成する。ピキア酵母にDNAを挿入し、寒天プレートで培養することで、形質転換されたコロニー（変異株）を得る。得られた変異株を培養し、メタノールを添加して発現誘導を行う。菌体を除去後、培地成分のタンパク質定量を行うことで、外分泌されたタンパク質の発現量を比較する。次にアルブミンと機能性タンパク質との融合タンパク質の発現系も同様に構築し、発現量を評価する。分子動力学シミュレーションを実施し、実験結果と比較する。分泌シグナルペプチドに対して、アルブミンや融合タンパク質の発現量の相関を評価することで、高発現融合タンパク質の合理的に設計・合成できる手法の確立を目指す。
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