| 研究課題/領域番号 |
21KK0265
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
谷川 美頼 浜松医科大学, 医学部, 特任助教 (50553658)
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| 研究期間 (年度) |
2022 – 2024
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| キーワード | センサー / TORC1 / ラパマイシン / アミノ酸 / 栄養応答 |
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| 研究実績の概要 |
本共同研究は「Pib2植物オルソログFYVE1が細胞内グルタミンセンサーとして機能し、TORC1を活性化するのか」を検証している。
まずはFYVE1がTORC1経路を制御している可能性を検証するために、シロイヌナズナのFYVE1の機能欠失型変異株(fyve1-1)のTORC1活性をモニターした。その結果、fyve1-1株では野生株と比較して優位にTORC1活性が低下していた。しかしfyve1-1は発生の早い段階で致死のため、詳細な生化学的解析が困難であった。そこでFYVE1のドミナントネガティブ変異体を利用する手法を試みた。酵母Pib2においてはPib2のＣ末端がPib2によるTORC1の活性化に必須である。よってPib2のＣ末端欠損変異体の高発現はTORC1と結合するものの、活性化できないために生育阻害を引き起こす。同様にFYVE1のC末端欠損変異の高発現によってもTORC1に対するドミナントネガティブ効果が観察されるかを検討している。まずはシロイヌナズナ培養細胞でFYVE1のＣ末端欠損変異体の高発現を行った。その結果、変異体を高発現した細胞ではコントロール株と比較してグルタミンによるTORC1の活性化の程度が低下していた。このことはFYVE１Ｃ末端欠損変異体がグルタミンによるTORC1の活性化を阻害することを示唆している。また、シロイヌナズナのFYVE1のＣ末端欠損変異体の高発現株を作成することに成功した。現在この株におけるTORC1活性をモニターしようとしている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予想したとおりfyve1欠失変異株ではTORC1の活性が低下していることを明らかにした。またドミナントネガティブ効果を示すfyve1の変異を見出し、その変異を高発現する植物の形質転換体を得ることにも成功している。
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| 今後の研究の推進方策 |
FYVE1のＣ末端欠損変異体高発現株におけるTORC1の活性化をモニターする予定である。定常状態だけでなくグルタミンをはじめとしたアミノ酸による活性化が変異体の高発現により阻害されるのかを観察する。また、この株の生育が野生株と比較して遅滞を示すのかを種々の培地上で比較する予定である。具体的には窒素源を含む培地、含まない培地において比較する予定でいる。
またFYVE1とTORC1が結合するのかをpull-down assayにより検討する。すでにFYVE1は大腸菌より組換えタンパク質と精製することに成功している。またHAタグを付加したTORC1の構成因子高発現株の作成にも成功している。これらを用いてpull-down assayを行う。
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