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2011 年度 実績報告書

スーパー制限酵素を用いたゲノム・マニュピュレーション工学の創成

研究課題

研究課題/領域番号 22000007
研究種目

特別推進研究

研究機関筑波大学

研究代表者

小宮山 真  筑波大学, 生命領域学際研究センター, 教授 (50133096)

研究分担者 須磨岡 淳  筑波大学, 医学医療系, 講師 (10280934)
徐 岩  宮崎大学, 医学部, 准教授 (40506763)
樋口 麻衣子  東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助教 (30420235)
キーワードゲノム編集 / 相同組換え / ペプチド核酸 / セリウム / 人工酵素 / バイオテクノロジー / 核酸 / 制限酵素
研究概要

当初の研究計画に沿って、スーパー制限酵素(ARCUT)を用いてヒトゲノムを所定の場所で選択的に切断し、所望のDNA断片を切り出すとともに、ヒト細胞内におけるゲノム改変について追究した。また、ARCUTを広範に適用するために、「第2世代のARCUT」の開発を行った。
テロメアをターゲットし、DNA断片の切り出しを行った。テロメアはどの染色体でも全て同じ配列であるが、この繰り返しが終了した場所の配列はそれぞれの染色体に固有である。そこで、ここをターゲットとし、抽出した全ゲノムDNAに対して、対応するARCUTで処理した。その結果、11qとXp/Ypの各染色体から得られたテロメアの長さは互いに1.6倍も異なることが分かった。
ヒト細胞内に導入されたプラスミドに対して、相同組み換えがARCUTにより促進されること、大きなサイズの遺伝子(約1 kb)が挿入できること、組換え効率がDNAドナー長に顕著に依存すること、細胞周期の制御で組換え効率が向上できること などが明らかになった。ただし、組換え効率は、ARCUTの導入時期、導入方法をはじめとする様々な要因が複雑に関与していることも明らかになった。
ホモプリン・ホモピリミジン配列に対して、PNA/DNA系三重らせん形成を利用し、効率的に切断することに成功した。また、高塩濃度でPNAのインベージョンが非効率化してしまう点に関しては、ポリアミド系オリゴマーとPNAとをハイブリッド化して課題を解決した。GC-rich配列対するPNA/DNA系のグアニン四重鎖形成手法と合わせ、ほぼすべての配列を認識して切断する第2世代ARCUTを構築することに成功した。
その他の関連技術として、ARCUTで切り出したDNA断片の末端は、通常の制限酵素の切断末端とは構造が大きく異なるが、これと相補的な末端構造を持つDNA断片を簡便に調製するPCR法を確立した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ヒト細胞から抽出したゲノムの操作に関する研究は、ほぼ計画通りに順調に進行しており、今後このまま引き続き進めることにより十分な成果が得られるものと思われる。それぞれの染色体からテロメアを切り出す技術が確立できたことは重要である。また我々の研究室では、テロメアに関する研究を別箇に進めるとともに、テロメア付近で最近新たに発見された“テロメア配列を持つRNA”に関する新知見を蓄積してきた。したがって、本研究で確立した“テロメア取得技術”とこれらの知見とを融合することにより、さらに大きな成果があげられると信じている。また、ARCUTの活用により、ゲノムの中の特定部位に結合するタンパク質などの解析も可能であり、関連科学に大きなインパクトを与えられるはずである。従来法では「特定のタンパク質がゲノムのどこに結合するか」が解析できるだけであったのに対し、本研究では、例えば、「特定のガン関連遺伝子の発現に際してどのようなタンパク質がどのように結合するか」が直接に明らかにできるので、従来法とは異なる次元の重要情報が提供できるはずである。ヒトゲノムの中のほぼすべての配列を認識して切断できるようになっているので、残された期間で、十分に大きな成果として完成できるものと考えている。
一方、ARCUTのヒト細胞内での利用に関しては、細胞の持つ複雑さのために、細胞外の応用と比べると困難である。これは当初よりある程度予想されたことであり、細胞内反応では、細胞の種類、周期、ARCUT の導入方法、導入時期など数多くのパラメーターが複雑に相関しているようである。しかし、これまでの検討過程で、これらのパラメーターを系統的に変化して相同組み換え効率を評価してきた。今後は、得られた基礎的知見を有機的に組み合わせ、本プロジェクトの研究期間の終了時までには、安定した効率で相同組み換えを引き起こす系を確立する予定である

今後の研究の推進方策

本研究は全体的にはほぼ順調に進行している。しかし、ARCUTのヒト細胞内での応用に関しては解決すべき課題もまだ残っている。そこで、2つの観点から研究をさらに進め、ゲノムのマニピュレーション技術として確立する。
・ARCUT応用技術の確立
(1)ヒト細胞から抽出したゲノムDNAを所定位置で切断し、所定断片を入手する手法を確立する。ゲノム切断に関しては一応完成段階にあるので、断片を効率的にかつ純度良く分離する方法を追究する。また、テロメアと対象としてゲノムの所定断片の取得の有用性を具現化する。(2)DNA結合タンパク質やnon-coding RNAの結合したゲノム断片の取得とその解析を行う。ヒト細胞をホルムアルデヒドで処理し、タンパク質やnon-coding RNAをゲノム中の特定のDNA領域に固定化し、この近傍をARCUTで切断することでゲノム断片との複合体を入手する。この複合体を分離後、質量分析等で解析してゲノム中のどの場所にどのようなタンパク質がどの時点で結合するかに関する詳細情報を明らかにする。(3)ARCUTによって誘導される相同組換え効率は、細胞の種類や細胞周期、ARCUTの導入時期、導入方法をはじめとする様々な要因に大きく依存することも分かり、これがARCUTの本格的な実用化の障害となっている。考えられる要因のそれぞれが組換え効率に与える影響を明らかにしてきたので、今後はこれらの結果を総合的に評価し、組換え効率の安定制御を実現する。
・第2世代ARCUTの確立
すでに、細胞内での認識能・切断能の向上、認識・切断配列の拡張、さらにはCe(IV)錯体のARCUTへの固定化による副反応の抑制 に成功している。残された期間でもさらに研究を重ね、ゲノムのどの場所でも、どのような条件でも効率よく切断できるツールの確立に努める。

  • 研究成果

    (25件)

すべて 2012 2011 その他

すべて 雑誌論文 (9件) (うち査読あり 9件) 学会発表 (14件) (うち招待講演 3件) 図書 (1件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Introduction of multiphosphonate ligand to peptide nucleic acid for metal ion conjugation.2012

    • 著者名/発表者名
      Y. Aiba
    • 雑誌名

      Artificial DNA: PNA & XNA

      巻: 3 ページ: 73-79

    • DOI

      10.4161/adna.20727

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Chemical and biological approaches to improve the efficiency of homologous recombination in human cells mediated by artificial restriction DNA cutter. H.2012

    • 著者名/発表者名
      H. Katada
    • 雑誌名

      Nucleic Acids Res.

      巻: 40 ページ: -

    • DOI

      10.1093/nar/gks185

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Clear-cut Observation of PNA Invasion using Nanomechanical DNA Origami Devices.2012

    • 著者名/発表者名
      T. Yamazaki
    • 雑誌名

      Chem. Commun.

      巻: 48 ページ: 11361 - 11363

    • DOI

      10.1039/c2cc36358e

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Design and applications of artificial restriction DNA cutters for site-selective scission of genomes.2012

    • 著者名/発表者名
      M. Komiyama
    • 雑誌名

      Bull. Chem. Soc. Jpn.

      巻: 85 ページ: 533 - 544

    • DOI

      10.1246/bcsj.20110318

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Enzyme Treatment-Free and Ligation-Independent Cloning Using Caged Primers in Polymerase Chain Reaction.2012

    • 著者名/発表者名
      A. Kuzuya
    • 雑誌名

      Molecules

      巻: 17 ページ: 328 - 340

    • DOI

      10.3390/molecules17010328

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Intracellular localization of PNA in human cells upon its introduction by electroporation.2012

    • 著者名/発表者名
      N. Shigi
    • 雑誌名

      Nat. Product Commun.

      巻: 7 ページ: 349 - 352

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Artificial site-selective DNA cutters to manipulate single-stranded DNA.2012

    • 著者名/発表者名
      Y. Aiba
    • 雑誌名

      Polym. J.

      巻: 52 ページ: 413 - 435

    • DOI

      10.1038/pj.2012.37

    • 査読あり
  • [雑誌論文] G-rich Sequence-specific Recognition and Scission of Human Genome by PNA/DNA Hybrid G-quadruplex Formation.2012

    • 著者名/発表者名
      T. Ishizuka
    • 雑誌名

      Angew. Chem. Int. Ed.

      巻: 51 ページ: 7198 - 7202

    • DOI

      10.1002/anie.201201176

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Artificial DNA cutters for DNA manipulation and genome engineering.2011

    • 著者名/発表者名
      Y. Aiba
    • 雑誌名

      Chem. Soc. Rev.

      巻: 40 ページ: 5657 - 5668

    • DOI

      10.1039/c1cs15039a

    • 査読あり
  • [学会発表] Manipulation of Huge DNA by Artificial Restriction DNA Cutter (ARCUT).2011

    • 著者名/発表者名
      M. Komiyama
    • 学会等名
      6th Cambridge Symposium on Nucleic Acids Chemistry and Biology
    • 発表場所
      Cambridge (UK)
    • 年月日
      20110904-20110907
    • 招待講演
  • [学会発表] Artificial DNA cutter to manipulate huge genome.2011

    • 著者名/発表者名
      M. Komiyama
    • 学会等名
      15th Symposium on Chemistry of Nucleic Acid Compounds
    • 発表場所
      Cesky Krumlov (Czech Republic)
    • 年月日
      20110605-20110610
    • 招待講演
  • [学会発表] Chemistry-based restriction DNA cutter for genome manipulation

    • 著者名/発表者名
      M. Komiyama
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      パシフィコ横浜(神奈川県)
    • 招待講演
  • [学会発表] 人工制限酵素による細胞内ゲノム改変

    • 著者名/発表者名
      多賀 亮介
    • 学会等名
      日本化学会 第92春季年会
    • 発表場所
      慶應義塾大学日吉キャンパス(神奈川)
  • [学会発表] Gene targeting in human cells using Artificial Restriction DNA CUTter (ARCUT)

    • 著者名/発表者名
      Narumi Shigi
    • 学会等名
      The 38th International Symposium on Nucleic Acid Chemistry
    • 発表場所
      北海道大学(北海道)
  • [学会発表] Site-specific scission and recombination of mitochondrial DNA by using Artificial restriction DNA cutter

    • 著者名/発表者名
      Toshimasa Harumoto
    • 学会等名
      The 38th International Symposium on Nucleic Acid Chemistry
    • 発表場所
      北海道大学(札幌)
  • [学会発表] ヒトテロメアRNAの構造と生化学機能およびテロメアRNAを標的とする小分子の探索

    • 著者名/発表者名
      徐 岩
    • 学会等名
      第5回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      つくば国際会議場(茨城)
  • [学会発表] Ce(IV)/EDTA とペプチド核酸・ペプチドコンジュゲートによる位置選択的 DNA 切断

    • 著者名/発表者名
      愛場 雄一郎
    • 学会等名
      第28回希土類討論会
    • 発表場所
      タワーホール船堀(東京都)
  • [学会発表] 細胞内応用を志向した人工DNAカッター(ARCUT)の開発

    • 著者名/発表者名
      愛場 雄一郎
    • 学会等名
      第21回バイオ・高分子シンポジウム
    • 発表場所
      東京大学先端科学技術研究センター(東京都)
  • [学会発表] PNA-peptide conjugateの2重鎖DNA位置選択的切断への応用

    • 著者名/発表者名
      愛場 雄一郎
    • 学会等名
      第60回高分子討論会
    • 発表場所
      岡山大学 津島キャンパス(岡山県)
  • [学会発表] ナノメカニカル DNAオリガミデバイスのアロステリック構造制御による高感度単分子検出

    • 著者名/発表者名
      葛谷 明紀
    • 学会等名
      第5回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      つくば国際会議場(茨城県)
  • [学会発表] 細胞内応用へ向けた人工DNAカッターARCUTの高機能化

    • 著者名/発表者名
      愛場 雄一郎
    • 学会等名
      第5回バイオ関連化学シンポジウム
    • 発表場所
      つくば国際会議場(茨城県)
  • [学会発表] Nanomechanical DNA Origami Devices as“ Single-Molecule Beacons”

    • 著者名/発表者名
      Akinori Kuzuya
    • 学会等名
      The 38th International Symposium on Nucleic Acid Chemistry
    • 発表場所
      北海道大学(北海道)
  • [学会発表] Site-selective scission of double-stranded DNA by using PNA-peptide conjugate

    • 著者名/発表者名
      Wataru Kameshima
    • 学会等名
      The 38th International Symposium on Nucleic Acid Chemistry
    • 発表場所
      北海道大学(北海道)
  • [図書] "Covalent and non-covalent conjugates of oligonucleotide as artificial restriction DNA cutters" In Keith R Fox (Eds.) "DNA Conjugates and Sensors"2012

    • 著者名/発表者名
      Makoto Komiyama
    • 総ページ数
      278 - 295
    • 出版者
      Royal Society of Chemistry
  • [備考] 小宮山研究室HP

    • URL

      http://www.mkomi.rcast.u-tokyo.ac.jp/

URL: 

公開日: 2014-07-24  

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