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2014 年度 実績報告書

スーパー制限酵素を用いたゲノム・マニュピュレーション工学の創成

研究課題

研究課題/領域番号 22000007
研究機関筑波大学

研究代表者

小宮山 眞  筑波大学, 生命領域学際研究センター, 教授 (50133096)

研究分担者 徐 岩  宮崎大学, 医学部, 准教授 (40506763)
須磨岡 淳  東京工科大学, メディア学部, 教授 (10280934)
研究期間 (年度) 2010-04-21 – 2015-03-31
キーワードゲノム編集 / 相同組替え / ペプチド / セリウム / 人工酵素 / バイオテクノロジー / 核酸 / 制限酵素
研究実績の概要

スーパー制限酵素は、DNAの塩基配列を認識するペプチド核酸(PNA)とDNAを切断する分子であるCe(IV)/EDTAにより構成されている。研究を進めるなかで、従来使用していたCe(IV)/EDTAのDNA切断活性は必ずしもすべての使用目的に合致するほど高くないことが判明した。これまで、切断効率を高めるために種々錯体について検討したが、Ce(IV)/EDTAよりも高活性な錯体は現在のところ見いだせていない。そこで、天然酵素も評価対象としたところ、ヌクレアーゼS1のような一本鎖特異的なヌクレアーゼを用いるとCe(IV)/EDTAより高い効率でゲノムを目的位置で切断できることが判明した。これを用いて、ヒトゲノムから目的のDNA断片を切り出すことに成功した。用いている酵素は遺伝子工学に一般に使用される酵素であり、本手法はゲノム解析のツールとなり得ることが期待できる。
PNAのインベージョンは、生理条件程度の塩濃度において大きく阻害されることが知られている。このため、細胞内でPNAを二本鎖DNAに対してインベージョンさせることは困難と考えられていた。今回、ポリエチレングリコールなどの添加剤を用いて生体環境を模倣した分子クラウンディング状態でインベージョン反応を試みたところ、高い塩濃度下においても効率的にインベージョンが進行することを見いだした。これは、生体内でのPNAのさらなる応用の可能性を保障する結果である。
さらに、テロメア末端の切り出しに関して、本研究により見いだしたスーパー制限酵素を用いた手法を最適化してプロトコール化を行った。また、ヒトテロメア末端のDNA-RNAハイブリッド型のグアニン四重鎖構造の役割を提案した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

スーパー制限酵素の細胞外での応用については着実な進展が見られた。特に、DNA切断分子としてCe(IV)/EDTAだけではなく、ヌクレアーゼS1などの1本鎖DNA特異的なヌクレアーゼを作用させると、ゲノムDNAを選択的に切断することが可能であることを見いだしたことは特筆すべきことである。本手法をさらに発展させて、ビオチン修飾PNAを用いたゲノムDNAの切断とこれを用いた目的断片の精製とを組み合わせることで、分子生物学者にも比較的容易に利用できるバイオツールが開発できるものと確信している。
細胞内でのスーパー制限酵素の応用に関しては、細胞の複雑さ故に困難な部分が多く、再現性をさらに詳細に検討している。また、Ce(IV)/EDTAの代わりにヌクレアーゼの遺伝子を細胞に導入する系についても試み、ゲノム編集を実現すべく努力している。

今後の研究の推進方策

・細胞外での応用
ゲノム中からのDNA断片の精製法を確立し、ヒト細胞から抽出したゲノムDNAを所定位置で切断して、所定断片を回収する手法を提案する。さらに、提案した手法を活用し、ゲノムの特定領域における塩基修飾や塩基損傷について解析する手法を確立する。また、細胞をホルムアルデヒド処理してタンパク質やnon-coding RNAが固定化されたゲノムDNAを入手し、これをスーパー制限酵素で切断することで、タンパク質やnon-coding RNAと所定DNA断片との複合体を入手する方法へと発展させる。本手法により、ゲノム中のどの場所にどのようなタンパク質がどの時点で結合するかに関する詳細情報を得る。得られた情報は、これまでに広く用いられている免疫沈降法の欠点を補い、さらに厳密な分子情報を提供するものであり、関連分野の発展に大きく寄与できるものと期待している。
・細胞内での応用
これまでにも問題になっていた相同組換えの効率の再現性について、得られた結果を総合的に再評価し、最適化を行う。ゲノム構造と相同組換え効率の相関を明らかにするため、BFPをGFPに変換する相同組換えだけではなく、ヒト細胞に内在する遺伝子をターゲットとした相同組換えを検討する。また、ヒト以外の細胞を新たな対象として選択し、スーパー制限酵素による相同組換えに対する基礎的知見を蓄積するとともに本手法の汎用化を目指す。さらに、Ce(IV)のPNAへの固定化による副反応の抑制についても、残された期間で研究を重ね、より汎用性の高い化学ツールの確立に努める。

  • 研究成果

    (9件)

すべて 2015 2014

すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 7件) 学会発表 (2件)

  • [雑誌論文] Promotion of double-duplex invasion of peptide nucleic acid through conjugation with nuclear localization signal peptide2015

    • 著者名/発表者名
      Y. Aiba, Y. Honda, M. Komiyama
    • 雑誌名

      Chem. Eur. J.

      巻: 21 ページ: 4021-4026

    • DOI

      10.1002/chem.201406085

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Clipping of Telomere from Human Chromosomes using Chemistry-based Artificial Restriction DNA Cutter2015

    • 著者名/発表者名
      T. Ishizuka, Y. Xu, and M. Komiyama
    • 雑誌名

      Curr. Protoc. Nucleic Acid Chem

      巻: 61

    • 説明
      in press
    • 査読あり
  • [雑誌論文] Thiazole orange-conjugated peptide nucleic acid for fluorescent detection of specific DNA sequences and site-selective photodamage2014

    • 著者名/発表者名
      M. Tanaka, N. Shigi, J. Sumaoka, and M. Komiyama
    • 雑誌名

      RSC Adv.

      巻: 4 ページ: 63533-63538

    • DOI

      10.1039/C4RA13780A

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Clipping of predetermined fragments from human genome by Slnuclease-PNA combinations2014

    • 著者名/発表者名
      X. Li, S. Muneoka, N. Shigi, J. Sumaoka, and M. Komiyama
    • 雑誌名

      Chem. Commun.

      巻: 50 ページ: 8674-8676

    • DOI

      10.1039/C4CC01420K

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Molecular Crowding Facilitates Double-duplex Invasion of Pseudo-complementary Peptide Nucleic Acid in High Salt Medium2014

    • 著者名/発表者名
      J. Sumaoka and M. Komiyama
    • 雑誌名

      Chem. Lett.

      巻: 43 ページ: 1581-1583

    • DOI

      10.1246/cl.140620

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Finding of a human telomere DNA-RNA hybrid G-quadruplex formed by human telomeric 6-mer RNA and 16-mer DNA using click chemistry : Aprotective structure for telomere end2014

    • 著者名/発表者名
      Y. Xu, Y. Suzuki, T. Ishizuka, C.-D. Xiao, X. Liu, T. Hayashi, and M. Komiyama
    • 雑誌名

      Bioorg. Med. Chem.

      巻: 22 ページ: 4419-4421

    • DOI

      10.1016/j.bmc.2014.05.053

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Orthogonal enzyme arrays on a DNA origami scaffold bearing size-tunable wells2014

    • 著者名/発表者名
      T. Yamazaki, J.G. Heddle, A. Kuzuya, and M. Komiyama
    • 雑誌名

      Nanoscale

      巻: 6 ページ: 9122-9126

    • DOI

      10.1039/c4nr01598c

    • 査読あり
  • [学会発表] チアゾールオレンジ修飾ペプチド核酸による二本鎖DNA中での特定配列の蛍光検出と位置選択的光損傷2015

    • 著者名/発表者名
      田仲真紀子、鴫成美、須磨岡淳、小宮山眞
    • 学会等名
      第95回日本化学会春季年会
    • 発表場所
      日本大学船橋キャンパス(千葉県船橋市)
    • 年月日
      2015-03-26
  • [学会発表] Site-specific scission of human genome for efficient isolation of its specific region2014

    • 著者名/発表者名
      A. Rajendran, N. Shigi, X. Li, J. Sumaoka, M. Komiyama
    • 学会等名
      The 41st International symposium on nucleic acids chemistry
    • 発表場所
      Kitakyushu international conference center(福岡県北九州市)
    • 年月日
      2014-11-05

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公開日: 2016-06-01  

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