| 研究課題/領域番号 |
22241050
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
森 浩禎 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 教授 (90182203)
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| 研究分担者 |
山田 守 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30174741)
松野 浩嗣 山口大学, 理工学研究科, 教授 (10181744)
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| キーワード | 大腸菌 / 遺伝的ネットワーク / バーコード欠失株 / 定常期 / 次世代型シーケンサー / population |
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| 研究概要 |
我々は、開発済みの全遺伝子遺伝子欠失株ライブラリーと組み合わせることで、システマテックに2重欠失株を作製し遺伝的ネットワーク解析を進める。それに必要な新規の1遺伝子欠失株ライブラリーに20塩基の分子バーコードを挿入することで、これまで不可能であった長期定常状態での細胞の生理機能ネットワーク解明を行うことを、本プロジェクトの目的とした。平成22年度の計画通り、新規bar code欠失株ライブラリーのbar code領域の塩基配列の決定とその評価を終え、順調に選別作業に入った。現在、検証を終えた株の選択と並び替えを行い、平成23年度前半に計画している混合培養による解析に向けて準備を進めている。
(1)bar code配列の確認は、次世代型シーケンサーを用いて行った。各対象遺伝子から候補株を1株ずつ選択し、全てを混合した後、Roche454タイプの小型版を用いて配列情報をえた。その後、隣接する遺伝子配列を利用して、欠失遺伝子の同定と、bar code領域の配列の切り出しと確認を行った。この操作を2候補株について行い、その結果、全4000の対象遺伝子に対して、3700の候補株を得ることができている。
(2)bar codeの評価を、その構造、ゲノム配列の類似性などの評価を行った。全ての欠失株の薬剤耐性、PCRによる構造確認、部分2媒体の確認、そしてbar code評価を終えた株より、独立に2株選定し、ライブラリーセットとし、一つは96穴マイクロタイタープレートにグリセロールストックとして保管、もう一方は96プレート単位で混合液を作製した。
(3)独立に保管した物は、今年度Hfrをシステマティックに進め、遺伝的ネットワーク解析を進める。一方、混合液は、全44本になるが、これらが全て準備できた段階で、均一の混合し、今後のbar code解析ようの全遺伝子欠失株混合液のシーズ液とする。
このシーズ菌株液を用いて、長期定常期における遺伝子欠失株のpopulaion変動をシーケンサーを用いて解析予定である。
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