時間分解蛍光測定によるタンパク質内部運動と協奏する水和構造変化の解析

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 22244054
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 中迫 雅由 慶應義塾大学, 理工学部, 教授 (30227764)
• 研究期間 (年度): 2010-04-01 – 2014-03-31
• キーワード: 蛋白質水和構造 / 水和構造解析 / ドメイン運動 / 非線形光学 / 溶媒応答 / トリプトファン蛍光 / Ｘ線結晶構造解析 / 分子動力学計算

研究概要

本研究は、タンパク質が水中で作動する際の水和構造の役割や影響を理解するため、タンパク質のドメイン運動と水和構造が協奏的に再構成するというシナリオを検証する。リプトファン周辺での水和水集団運動を、ピコ秒時間分解和周波蛍光測定法によって観測するとともに、結晶構造解析に基づいた分子動力学シミュレーションによって得られる実験データの理解を促す。
前年度得たグルタミン酸脱水素酵素の分子動力学計算トラジェクトリーについて、水和構造解析を実施した。特に、活性クレフトを構成し、ドメインの運動に影響を及ぼすTrp89とArg186に着目し、再現された結晶構造のロタマー状態と、ドメイン開閉状態及び水和構造の相関を調べ、残基近傍の水和サイトの生成・消滅とドメイン運動の協奏性を認めた。その分子論的裏付けのために、既に構築した経験的水和分布関数を用いて、各スナップショットの水和構造を再現したが、三次元RISMは水和構造を全く再現できなかった。最近開発された分子 Ornstein-Zernike方程式の適用を検討している。
時間分解蛍光測定では、信号強度を向上のために高強度レーザーを濃厚タンパク質溶液に照射すると一瞬にして変性が発生する。一方、強度を反射鏡で減衰させた場合、既設楕円鏡では、蛍光発光が集光率が低い。特に、水平面内での集光効率向上に向けて、カセグレン光学系を用いて蛍光光を大きな立体角で集めることを検討した。
Trpを有し、その周辺において構造変化が誘起されそうなタンパク質として、青色光受容蛋白質phototropinを取り上げ、そのＸ線構造解析を試みた。実験室のＸ線回折装置を用いて4Å分解能まで回折斑点を与える結晶を得た。構造解析が完了すれば、本研究で提案したスキームでドメイン運動とTrp周辺の水和構造変化を追跡する。

現在までの達成度 (区分)

理由

25年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

25年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Light-induced conformational changes of LOV (Light Oxygen Voltage-sensing domain) 1 and LOV2 relative to the kinase domain and regulation of kinase activity in Chlamydomonas phototropin (2014)
  • 著者名/発表者名: K. Okajima, Y. Aihara, Y. Takayama, M. Nakajima, S. Kashojiya, T. Hikima, T. Oroguchi, A. Kobayashi, Y. Sekiguchi, M. Yamamoto, T. Suzuki, A. Nagatani, M. Nakasako and S. Tokutomi
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 289 ページ: 413-422
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.515403
  • 査読あり
• [雑誌論文] Application of empirical hydration distribution functions around polar atoms for assessing hydration structures of proteins (2013)
  • 著者名/発表者名: D. Matsuoka and M. Nakasako
  • 雑誌名: Chemical Physics 巻: 419 ページ: 59-64
  • DOI: 10.1016/j.chemphys.2012.12.040
  • 査読あり
• [雑誌論文] 経験的水和分布関数の構築と蛋白質水和構造予測への応用 (2013)
  • 著者名/発表者名: 松岳大輔、中迫雅由
  • 雑誌名: タンパク質結晶の最前線（シーエムシー出版） 巻: なし ページ: 221-229
  • 査読あり
• [学会発表] Coherent X-ray diffraction imaging of non-crystalline particles with sub-micrometer dimensions
  • 著者名/発表者名: M. Nakasako, Y. Takayama, T. Oroguchi, Y. Sekiguchi, A. Kobayashi, K. Shirahama, M. Yamamoto, T. Hikima, K. Yonekura, S. Maki-Yonekura, Y. Kohmura, Y. Inubushi, Y. Takahashi, A. Suzuki, S. Matsunaga, Y. Inui, Y. Ichikawa, H. Kurumizaka, K. Tono, T. Kameshima, Y. Joti, T. Hoshi
  • 学会等名: Modeling biomolecular systems in cellular environment
  • 発表場所: Kyoto, Japan
  • 招待講演
• [学会発表] Empirical hydration distribution functions around polar atoms for studying
  • 著者名/発表者名: D. Matsuoka and M. Nakasako
  • 学会等名: The 13-th Korea Institute of Advanced Study (KIAS) Conference
  • 発表場所: Seoul, Korea
  • 招待講演
• [学会発表] 低温Ｘ線構造解析の展開 蛋白質水和構造解析からコヒーレントＸ線回折イメージングまで
  • 著者名/発表者名: 中迫雅由
  • 学会等名: 超高速光エレクトロニクス研究会・光波シンセシス研究グループ研究会・理研シンポジウム
  • 発表場所: 和光、埼玉
  • 招待講演
• [学会発表] 分子動力学計算によるグルタミン酸脱水素酵素ドメイン運動に協奏した水和構造変化の観察
  • 著者名/発表者名: 苙口友隆、中島 真、中迫雅由
  • 学会等名: 第１３回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 鳥取