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2012 年度 実績報告書

抑制性シナプスの新たな制御経路としての低分子量G蛋白質ARF6の機能解明

研究課題

研究課題/領域番号 22300114
研究機関北里大学

研究代表者

阪上 洋行  北里大学, 医学部, 教授 (90261528)

研究期間 (年度) 2010-04-01 – 2014-03-31
キーワード抑制性シナプス / シナプス可塑性 / 低分子量GTP結合蛋白質 / シナプス後肥厚部
研究概要

本研究は、我々が見出した抑制性シナプスのシナプス後膜に局在する低分子量GTP結合蛋白質ARF6に対するグアニンヌクレオチド交換因子であるBRAG3 (別名 IQSEC3, synArfGEF)の抑制性シナプスにおける機能を解剖学的に明らかにすることを目的とする。平成24年度は以下の点を明らかにした。
(1)網膜におけるBRAG3の発現局在:網膜における免疫組織学的解析を行った結果、BRAG3免疫反応は内網状層に点状に分布し、抑制性シナプスの足場タンパク質であるgephyrinと高い頻度 (83.9%)で共存を示し、さらにGABA(A)受容体およびグリシン受容体の一部と共存を示した。一方、BRAG3陽性反応は、興奮性シナプスの足場タンパク質であるPSD-95との共存は示さなかった。さらに免疫電顕解析により、BRAG3が内網状層の対称性シナプスのシナプス後膜に局在することを見出し、網膜においてもBRAG3が抑制性シナプスにおいて機能することが明らかになった。以上の研究成果は、Journal of Comparative Neurologyに掲載された (Sakagami et al., 2013)。
(2)BRAG3のスプライバリアントの単離と発現解析:ゲノム解析とPCR法により、BRAG3がC末領域のスプラシングの相違による3つのバリアント(BRAG3a, BRAG3c, BRAG3d)が存在することを見出した。BRAG3aの152アミノ酸よりなり特異的なC末領域にはプロリンが豊富でC末端にはPDZ結合モチーフが存在する一方、新たに同定したBRAG3cとBRAG3dの23、20アミノ酸からなるC末領域には既知のモチーフは認められない。今後、バリアントによる局在発現の差異の有無をin situハイブリダイゼーション法と特異抗体の作製による免疫組織化学法により検討する予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

BRAG3が網膜においても抑制性シナプスの後膜に局在することを見出し、Journal of Comparative Neurologyに受理された(Sakagami et al., 2013)点は高く評価できる。さらに、BRAG3のスプライスバリアントの同定し、また、BRAG3の抑制性シナプスにおける局在機構に関して、ロンドン大学のRobert J. Harvey教授との共同研究を開始している。以上の点で、本研究計画内容を着実に進展させているものと高く評価できる。

今後の研究の推進方策

実施計画に従って以下の研究内容で進める。
(1)BRAG3の抑制性シナプス局在機構の解明:BRAG3がジストロフォンと結合することを見出した(J. Neurochem., 2011)が、この相互作用のBRAG3の抑制性シナプスへの局在への関与を検証するために、ジストロフィン欠損マウス(mdx)を用いて、BRAG3のシナプス局在の変化の有無を免疫組織学的に精査する。
(2)BRAG3のスプライスバリアントの発現局在解析:バリアントによる局在発現の差異の有無をin situハイブリダイゼーション法と特異抗体の作製による免疫組織化学法により検討する
(3)ARF6経路の抑制性シナプス形成における機能解明:初代神経培養細胞を用いてRNA干渉法によりBRAG3-ARF6経路の発現を抑制した場合の抑制性シナプスの形成への影響を、抑制性シナプスの密度、抑制性神経伝達物質受容体(GABA(A)受容体、グリシン受容体)その足場蛋白質gephyrinのシナプス集積及び膜上への発現の変化の有無などを指標にして検討する。
(3)ARF6経路の抑制性シナプスにおける分子ネットワークの解明:ARF6及びBRAG3との結合分子を同定することにより分子ネットワークを明らかにする。実験方法として酵母ツーハイブリット法によりARF6及びBRAG3を餌にして脳cDNAライブラリーをスクリーニングする。また、ARF6及びBRAG3に対する特異抗体を用いた免疫沈降法により得られた免疫沈降物を質量分析装置により複合体を形成する分子の網羅的な単離を試みる。

  • 研究成果

    (15件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (7件) (うち査読あり 7件) 学会発表 (7件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] Distinct synaptic localization patterns of brefeldin A-resistant guanine nucleotide exchange factors BRAG2 and BRAG3 in the mouse retina2013

    • 著者名/発表者名
      Sakagami H, Katsumata O, Hara Y, Tamaki H, Watanabe M, Harvey RJ, Fukaya M
    • 雑誌名

      J. Comp. Neurol

      巻: 521 ページ: 860-876

    • DOI

      10.1002/cne.23206

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Involvement of CaMKIV in neurogenic effect with chronic fluoxetine treatment2013

    • 著者名/発表者名
      Song N, Nakagawa S, Izumi T, Toda H, Kato A, Boku S, Inoue T, Sakagami H, Li X, Koyama T
    • 雑誌名

      Int J Neuropsychopharmacol

      巻: 16(4) ページ: 803-812

    • DOI

      10.1017/S1461145712000570

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Accumulation of alpha-Synuclein Triggered by Presynaptic Dysfunction2013

    • 著者名/発表者名
      Nakata Yasuto
    • 雑誌名

      JOURNAL OF NEUROSCIENCE

      巻: 32 ページ: 17186-17196

    • DOI

      10.1523/JNEUROSCI.2220-12.2012

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Inducible and Conditional Deletion of Extracellular Signal-regulated Kinase 5 Disrupts Adult Hippocampal Neurogenesis2012

    • 著者名/発表者名
      Pan YW, Zou J, Wang W, Sakagami H, Garelick MG, Abel G, Kuo CT, Storm DR, Xia Z
    • 雑誌名

      J Biol Chem

      巻: 287(28) ページ: 23306-23317

    • DOI

      10.1074/jbc.M112.344762

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Pilt is a coiled-coil domain-containing protein that localizes at the trans-Golgi complex and regulates its structure2012

    • 著者名/発表者名
      Tamaki H, Sanda M, Katsumata O, Hara Y, Fukaya M, Sakagami H
    • 雑誌名

      FEBS Lett

      巻: 586 ページ: 3064-3070

    • DOI

      10.1016/j.febslet.2012.07.051

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Epigenetic Silencing of HOPX Promotes Cancer Progression in Colorectal Cancer2012

    • 著者名/発表者名
      Katoh Hiroshi
    • 雑誌名

      NEOPLASIA

      巻: 14 ページ: 559

    • DOI

      10.1593/neo.12330

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Thromboxane A(2) receptor signaling promotes liver tissue repair after toxic injury through the enhancement of macrophage recruitment2012

    • 著者名/発表者名
      Minamino Tsutomu
    • 雑誌名

      TOXICOLOGY AND APPLIED PHARMACOLOGY

      巻: 259 ページ: 104-114

    • DOI

      10.1016/j.taap.2011.12.013

    • 査読あり
  • [学会発表] Expression and functional roles of phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase (PIP5K) γ in the developing cerebral cortex.2013

    • 著者名/発表者名
      原 芳伸
    • 学会等名
      第117回日本解剖学会総会・全国学術集会
    • 発表場所
      香川
    • 年月日
      20130328-20130330
  • [学会発表] Splice variant-dependent subcellular localization of the Arf6 activator BRAG2 in the adult mouse brain2013

    • 著者名/発表者名
      深谷 昌弘
    • 学会等名
      第117回日本解剖学会総会・全国学術集会
    • 発表場所
      香川
    • 年月日
      20130328-20130330
  • [学会発表] Arf6の下流効果分子Rab11-FIP3/Arfophilin-1の神経細胞の樹状突起における役割2013

    • 著者名/発表者名
      矢崎 佑紀
    • 学会等名
      第117回日本解剖学会総会・全国学術集会
    • 発表場所
      香川
    • 年月日
      20130328-20130330
  • [学会発表] ARF6活性制御因子BRAG2/IQSEC1のスプライスバリアント依存的なシナプス局在2012

    • 著者名/発表者名
      深谷 昌弘
    • 学会等名
      第35回日本神経科学会
    • 発表場所
      名古屋
    • 年月日
      20120918-20120921
  • [学会発表] 成熟マウス脳におけるEFA6Aとおよびその結合分子SNX1の細胞内局在解析2012

    • 著者名/発表者名
      福島 大輔
    • 学会等名
      第35回日本神経科学会
    • 発表場所
      名古屋
    • 年月日
      20120918-20120921
  • [学会発表] Expression and functional roles of phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase (PIP5K) γ in the developing cerebral cortex.2012

    • 著者名/発表者名
      原 芳伸
    • 学会等名
      第8回欧州神経科学大会(FENS2012)
    • 発表場所
      バルセロナ、スペイン
    • 年月日
      20120714-20120718
  • [学会発表] DISTINCT LOCALIZATION OF THE BRAG/IQSEC FAMILY OF GUANINE NUCLEOTIDE EXCHANGE FACTORS FOR ARF6 IN THE MOUSE RETINA2012

    • 著者名/発表者名
      阪上 洋行
    • 学会等名
      第8回欧州神経科学大会(FENS2012)
    • 発表場所
      バルセロナ、スペイン
    • 年月日
      20120714-20120718
  • [備考] 北里大学医学部解剖学(阪上)単位ホームページ

    • URL

      http://www.med.kitasato-u.ac.jp/~sakagami

URL: 

公開日: 2014-07-24  

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