| 研究概要 |
本研究課題では神経回路機能の動作原理を解明するための方法論の構築と、それによる新たな「光・脳科学」を切り開くことを目指した。本年度は、そのために、培ってきた開口放出現象の光学的な解析法を発展させ、神経、分泌細胞の開口放出機構の解明を進めると共に、新たに神経活動と神経分泌のin vivo光イメージング法の構築を行った。特に、現有の多光子顕微鏡に、新たに非線形レーザー光学、新規蛍光タンパク質、光活性化を導入し、開口放出関連分子の定量的な機能アッセイの開発を試みた。神経分泌・開口放出機構の関連分子の同時可視化のための蛍光タグ化の方法論を確立することで、生体脳中において、開口放出を引き起こす分子機械として有力な候補分子(SNARE分子群)の動態、複合体形成などを多重可視化する方法論の確立を目指した。まず、1波長励起同時4波長蛍光計測系の高精度化及び、蛍光タンパク質シリウス,酸性小胞蛍光指示薬や水溶性蛍光色素等の使用による、SNARE複合体を構成するSNARE分子の動態と融合細孔の開口とを同時に可視化・定量するための観察システム系の確立を実施した。特に、モデル細胞としてRAW細胞から破骨細胞への分化誘導のための条件を検討した。その結果、適切な巻日数を開けての経時的なRANK処理が重要であることが新たに判った。また、RAW細胞にたいしてシリウスで蛍光タグ化したv-SNAREタンパク質VAMPの発現プラスミドの導入を試みたところ、酸性小胞特異的な発現に成功した。
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