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本研究課題では神経回路機能の動作原理を解明するための方法論の構築と、それによる新たな「光・脳科学」を切り開くことを目指した。本年度は、そのために、培ってきた開口放出現象の光学的な解析法を発展させ、神経、分泌細胞の開口放出機構の解明を進めると共に、新たに神経活動と神経分泌のin vivo光イメージング法の構築を行った。特に、現有の多光子顕微鏡に、新たに非線形レーザー光学、新規蛍光タンパク質、光活性化を導入し、開口放出関連分子の定量的な機能アッセイの開発を試みた。また、神経分泌・開口放出機構の関連分子の同時可視化のための蛍光タグ化の方法論を確立することで、生体脳中において、開口放出を引き起こす分子機械として有力な候補分子(SNARE分子群)の動態、複合体形成などを多重可視化する方法論の確立を目指した。まず、1波長励起同時4波長蛍光計測系の高精度化及び、シリウス等の蛍光タンパク質や酸性小胞蛍光指示薬や水溶性蛍光色素等の使用による、SNARE複合体を構成するSNARE分子の動態と融合細孔の開口とを同時に可視化・定量するための観察システム系の確立を実施した。本年度は脂肪細胞モデル系において小胞の形質膜との融合細孔形成過程における分子動態を可視化する目的で、蛍光タンパク質をタグ化した糖輸送体の発現系の構築を実施した。さらに、蛍光タンパク質間のＦＲＥＴを用いた新規の高感度遊離カルシウムイオンインジケーターであるカメレオンナノをユビキタスに発現するトランスジェニックマウスを用いて、膵臓外分泌腺急性単離標本におけるカルシウム依存性開口放出の2光子顕微鏡による可視化解析を実施し、Ca2+波動のFRETイメージングと開口放出の同時観察に成功した。一方、軸性偏光ビームの2光子顕微鏡における有効性を確かめると共に、新規近赤外超短光パルスレーザーを用いて、生体脳深部イメージングの検討を行った。
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