| 研究課題/領域番号 |
22300147
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| 研究機関 | 生理学研究所 |
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研究代表者 |
平林 真澄 生理学研究所, 行動・代謝分子解析センター, 准教授 (20353435)
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| キーワード | ノックアウトラット / 胚性幹細胞 / 遺伝子ターゲッティング / Pdx1遺伝子 / 相同組換え / エレクトロポレーション / キメララット / 膵臓欠損 |
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| 研究概要 |
遺伝子ターゲティングによるノックアウトラットの作製
ゲノム研究の発展とともに、遺伝子操作動物の需要はますます高まっており、マウスを用いた病態モデル動物関連の研究が発展してきた。しかしながら、ES細胞を用いた遺伝子ターゲッティング技術はマウスに限定されており、ラットではマウスES細胞の樹立から25年を経てようやくES細胞の樹立に漕ぎ着けたばかりである。一方、ゲノム解読による情報に基づいた創薬において、マウス以外の種の遺伝子改変動物に対する需要は高まっている。本年度は、遺伝子ターゲッティング法によるノックアウトラットを作製するため、表現型で容易に判断できるPdx1遺伝子(膵臓の発生に必須な遺伝子)を選択し、ターゲッティングベクターを構築した。このベクターをBNラット由来ES細胞およびBLKラット由来ES細胞にそれぞれエレクトロポレーション法で導入した後、ネオマイシンを含む培地で培養したところ、それぞれ1個ずつの相同組換え体を得た。得られた相同組換えES細胞を受精後45日目の胚盤胞期卵に顕微注入することによってキメラ胚を作製し、偽妊娠を誘起したレシピエント雌に移植したところ、それぞれ23匹および20匹の♂キメララットを得た。各♂キメララットと野生型♀ラットと交配し、Pdx-1遺伝子を欠損させたヘテロラットを作製し、1匹の生殖系列産仔を獲得することに成功した。現在、遺伝子欠損ヘテロラット同志による交配から、ホモ個体を作製中で、来年度はホモ個体における表現系(膵臓欠損)および遺伝子発現解析を実施する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Pdx-1遺伝子を破壊するコンストラクトを導入し、ES細胞で相同組換えを起こさせたクローンを得ることに成功した。このクローンをホスト受精卵に導入することでキメララットを作製し、生殖寄与個体(Pdx-1遺伝子を欠損させたヘテロラット)の獲得に成功した。現在ヘテロラット同志による交配を実施中で来年度にはホモ個体が得られる予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度は、ラットES細胞と遺伝子欠損動物を利用した臓器再生技術の確立を目指し、動物個体を用いて臓器を再生し、移植臓器として提供するための新しい技術の開発を試みる。さらに、KO動物を作製する際、キメラ動物(FO世代)を介して生殖寄与個体(F1世代)を獲得し、さらにヘテロ個体同志の交配によりホモKO個体(F2世代)を作製するのが一般的であるが、このプロセスを短縮するため、ES細胞を4倍体胚に導入することによりFO世代で100%、ES/iPS細胞由来ヘテロ個体を作製する技術(4倍体補完法)を試みる。
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