迅速な遺伝子破壊法を用いたマウス・ノンコーディングＲＮＡの機能解析

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 22310118
• 研究機関: 奈良県立医科大学
• 研究代表者: 堀江 恭二 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30333446)
• 研究期間 (年度): 2010-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: ES細胞 / ゲノム / 遺伝子 / non-oding RNA / 変異体

研究実績の概要

近年、哺乳動物細胞には、mRNA型のnon-coding RNAが大量に存在することが明らかとなった。しかし、non-coding RNAは、塩基配列からの機能推定が困難であり、機能面からの系統的・網羅的解析は、ほとんどなされていないのが現状である。本研究では、我々が独自に開発した両アレル変異導入法を用いて、non-coding RNAが破壊された変異マウスES細胞株を迅速に単離し、細胞株の表現型解析を通じてnon-coding RNAの機能的スクリーニングを行ってきた。
本年度は、スクリーニングした変異体について、ES細胞の未分化状態を示す遺伝子にGFPやVenusなどの蛍光蛋白を導入し、未分化状態の時系列解析を行った。１細胞の追跡を行うために、ヒストンH2BをmCherryと融合させた蛍光蛋白を恒常的に発現させて、核を標識した。蛍光蛋白のデータを生細胞で取得するには、励起光の照射による細胞毒性を最小限に抑える必要がある。このための培養条件の樹立や、顕微鏡システムについても、十分に検討を行った。さらに、対象とするnon-coding RNAの発現が高い細胞と低い細胞を、上記の蛍光蛋白をレポーターとして、FACSによりソーティングし、ソーティング後の細胞群間での分化誘導実験や、各細胞群におけるゲノムワイドな遺伝子発現パターンを解析した。この結果、ES細胞の未分化性と相関を示すnon-coding RNAを特定できた。

現在までの達成度 (段落)

26年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

26年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [雑誌論文] Simulation and estimation of gene number in a biological pathway using almost complete saturation mutagenesis screening of haploid mouse cells (2014)
  • 著者名/発表者名: Tokunaga M, Kokubu C, Maeda Y, Sese J, Horie K, Sugimoto N, Kinoshita T, Yusa K, Takeda J.
  • 雑誌名: BMC Genomics 巻: 15 ページ: 1016
  • DOI: 10.1186/1471-2164-15-1016
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Removal of reprogramming transgenes improves the tissue reconstitution potential of keratinocytes generated from human induced pluripotent stem cells (2014)
  • 著者名/発表者名: Ken Igawaa, Chikara Kokubu, Kosuke Yusa, Kyoji Horie, Yasuhide Yoshimura, Kaori Yamauchi, Hirofumi Suemori, Hiroo Yokozeki, Masashi Toyoda, Nobutaka Kiyokawa, Hajime Okita, Yoshitaka Miyagawa, Hidenori Akutsu, Akihiro Umezawa, Ichiro Katayama, Junji Takeda.
  • 雑誌名: Stem Cells Transl Med 巻: 3 ページ: 992-1001
  • DOI: 10.5966/sctm.2013-0179
  • 査読あり
• [学会発表] ホモ変異体マウスES細胞バンクを用いた包括的遺伝子機能解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 堀江恭二、吉田純子
  • 学会等名: 第37回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2014-11-25 – 2014-11-27
  • 招待講演
• [学会発表] Rapid identification of homozygous mutant mouse embryonic stem cell clones showing differentiation resistant or differentiation prone phenotype (2014)
  • 著者名/発表者名: Junko Yoshida, Kyoji Horie
  • 学会等名: Global Controls in Stem Cells
  • 発表場所: Biopolis, Syngapore
  • 年月日: 2014-11-05 – 2014-11-07
• [学会発表] Live cell imaging for the analysis of cellular heterogeneity in mouse embryonic stem cell mutant clones identified by forward genetic screening (2014)
  • 著者名/発表者名: Junko Yoshida, Kyoji Horie
  • 学会等名: 12th Annual Meeting of International Society for Stem Cell Research
  • 発表場所: Vancouver, Canada
  • 年月日: 2014-06-18 – 2014-06-21