| 研究概要 |
一般性の高いP450の基質スクリーニング法の確立を目的として、昨年度末までにP450が基質を酸化する際に生成するNAD(P)+を高感度に検出する手法を探索した。NAD(P)+と選択的に反応して蛍光を発する反応試薬を開発するために、各種化合物をスクリーニングした結果、2-アセチルベンゾフラン（2-ABF）が既存の試薬を凌駕する反応性を持ち、かつ良好な特性を持つ蛍光色素を与えることを見いだした。
そこで、今年度はまず、2-ABFを用いたNAD(P)+検出法（2ABF法）がP450の基質スクリーニングに使えるかどうかの評価を行なった。約21種のP450基質からなる小ライブラリーを、NAD(P)Hの存在下、各種P450と反応させ、生成したNAD(P)+を2-ABF法を用いて検出した。その結果、それぞれのP450の基質が有為に高いシグナルを与えることを確認した。次に、1053化合物からなる研究室所蔵の合成化合物ライブラリーから上記P450cam, P450BM3を含む複数のP450の基質スクリーニングを行なった結果、既存の基質と共にP450の基質としてはこれまでに知られていないタイプの化合物が多数検出され、改めて2-ABF法の高い有用性が示唆された。
一方、これらの新規P450基質候補化合物に加えて、NAD(P)Hの消費は促進させるが基質としては全く酸化されない化合物、即ちP450のアンカップリングを誘起させる化合物も本スクリーニングで多数検出されることが分かった。そこで、アンカップリング反応では主に過酸化水素が発生することを利用して、過酸化水素検出プローブを用いた過酸化水素検出と2-ABF法を連続的に行なうスクリーニング法も構築した。
最後に、2-ABF法を阻害剤スクリーニングに利用する検討も行ない、本手法が阻害剤スクリーニングに適用できることが示された。
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