| 研究概要 |
代謝反応の中枢を担うpyruvateからacetyl-CoAへの反応であるpyruvate decarboxylation経路を取り上げ, 合成代謝工学による人工的な再構築とその応用可能性を実証した.具体的にはまず、 pyruvate からacetyl-CoAへの反応であるpyruvate decarboxylation経路を利用するacetyl-CoA再生系において, 合成代謝工学に基づきApPDCとTtAlDHの二つの耐熱性酵素モジュールの組み合わせによる人工pyruvate decarboxylation経路を再構築した。ApPDCなどの中温性微生物由来の酵素など, 好熱性微生物由来の酵素ほどの耐熱性がない酵素であっても, 60℃における熱処理により耐熱性酵素モジュールを作製できたことから, 60℃程度の温度においてある一定の耐熱性を保有しており, かつ大腸菌などの中温性微生物内で酵素の発現が可能であれば中温性微生物由来の酵素であっても合成代謝工学へ応用できる事が実証された.人工pyruvate decarboxylation経路は高価な補酵素であるNAD+消費型の酸化反応であり, 反応を継続的に実施するためにはNAD+を反応に必要な等量用いることが必要であるが, NAD+再生系としてTtGluDHを導入することでNAD+再生系が機能し, 反応に必要なNAD+を等量用いる必要がないことが実証された. N-Acetyl-L-glutamateの生産においてCoA系化合物の総濃度が0.4 mMの反応ではCoA系化合物のTTNが約12, 0.04 mMの反応ではTTNが約73であり, 今回構築された人工pyruvate decarboxylation経路は新たなacetyl-CoA再生系として利用可能であることが示唆された.
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