研究課題
免疫サブトラクション法の再現性を検討するとともに、正逆のサブトラクションで、雄(♂)の接合装置に特異的な抗体の調製に挑戦した。1.ヒラアオノリの培養系統をさらに増やし、配偶子の大小が真正の性的二形性なのか単なる地域差なのかを解析した。系統関係を明瞭にするためにマイクロサテライトマーカーとオルガネラDNAマーカーを単離した。マイクロサテライトに関してはSNXリンカー・オリゴプローブ法で単離することに成功しているし、葉緑体とミトコンドリアもゲノム配列が公開されているアオサ藻網の近縁種の遺伝子配置を参照し、PCR-RFLPで識別できるDNAマーカーを得ることができた。2.免疫サブトラクション法で配偶子の細胞表層に接合装置の性的二形性を検出している。ウェスタンブロット解析から、免疫サブトラクション法の抗原となっているタンパク質は、250kDaと80kDaと推測している。免疫サブトラクション法の再現性を調査すると同時に、雌(♀)ではなく、雄(♂)の接合装置を認識する抗体を調製した。また、抗原タンパク質とその遺伝子を同定するために、発現cDNAクローンライブラリーを構築した。北大グループと共同で野外採集した配偶体から放出された褐藻の配偶子を使うことを検討している。3.FE-SEMは、試料の乾燥法を工夫することで、眼点や接合装置など細胞表層からでは識別が難しい構造を観察できるようにした。今回は、「凍結乾燥法」を工夫して、雌(♀)の接合装置に特異な顆粒状の構造を観察できるようにした。透過電顕も用いることで、雄(♂)の表層や接合装置に何か特異的な構造が観察できることを試しているところである。一方、FE-SEM免疫電顕に関しては、筑波大グループと共同で、サブトラクション法で調製した抗体が細胞表層の接合装置の何を認識しているかを調べていて、光学顕微鏡による免疫染色の解析が進んでいる。
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