| 研究概要 |
ほぼすべての生物は体内に生物時計をもち、この時計に支配されて様々な生理現象が約１日周期の概日リズムを示す。この時計発振系の基本的な分子骨格は転写・翻訳を介した負のフィードバック機構であり、哺乳類においては時計タンパク質BMAL1およびCLOCKが正の因子、PERおよびCRYが負の因子としての役割を果たす。BMAL1- CLOCKヘテロ二量体はbHLHドメインを介して、PerやCryなどの時計遺伝子上流に存在するE-box配列あるいはE-box様配列に結合し、転写を活性化する。BMAL1、CLOCKは生体内においてヘテロ二量体を形成してその機能を発揮する。この全体構造はHuangらによりマウスのBMAL1:CLOCK複合体の立体構造が決定された。そこで、bHLHドメインおよびPAS-Aドメインにおける ヘテロ2量体形成に及ぼす影響を調べた。
BMAL1:CLOCKの共発現を行うためにBMAL1,CLOCKともにPAS-AドメインまでをpETDuetベクターに導入しN末端側にHisタグ、さらにはCLOCKのN末端側にMaltose binding proteinを融合させて発現させた。CLOCK, BMAL1のbHLHドメイン、PAS-Aドメインに存在するLeu残基をGluあるいはAspに変異させ、2量体形成能を野生型と比較することにより、相互作用に重要な残基を調べた。その結果、bHLH上に変異を入れた場合、明らかに野生型よりも2量体形成能が約1/4に落ちたにも関わらず、PAS-Aドメインでは変化がないものから約6割程度の変化であった。このことから2量体形成にはbHLHドメインが重要であることが示唆された｡
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