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2011 年度 実績報告書

Toll様受容体を介したシグナル伝達機構の構造生物学的解析

研究課題

研究課題/領域番号 22370038
研究機関京都大学

研究代表者

杤尾 豪人  京都大学, 工学研究科, 准教授 (70336593)

キーワードMyD88 / IRAK / 自然免疫 / Toll様受容体 / NF-κB
研究概要

自然免疫応答は、TLR→リン酸化カスケード→NF-κB→炎症反応という情報伝達により引き起こされる。本研究では、この情報の流れを担う「実行分子群」が「相互作用」を通して、どのように上流から情報を受け取り、また下流へと伝達するのかを解明することを目標とする。
本年度は、TLRシグナルと細胞内アダプター蛋白質分子群を共有するIL-18シグナルの構造生物学的解析を行った。IL-18受容体はIL-1受容体の類縁体であり、イムノグロブリン様の細胞外ドメインと細胞内のTIRドメインを有する。このTIRドメインは、TLRシグナルにも含まれるMyD88と相互作用し、下流にシグナルを伝えることが知られている。さらに、その下流の経路は、TLRシグナルと同一であることから、IL-18シグナルの解析によりTLRシグナルの理解も深まると考えられる。
NMRによる相互作用解析
IL-18とIL-18受容体αの細胞外ドメイン(IL-18α)、およびIL-18受容体β細胞外ドメイン(IL-18β)の相互作用解析を行った。[2H,15N]-IL-18を調製し、ここにIL-18αを滴定しNMR測定を行い相互作用面を同定した。さらに、TROSYタイプの三重共鳴NMR測定を行い、IL-18部分の主鎖原子核の化学シフト帰属を行った。続いて、交差飽和法により複合体中の接触面を正確に決定した。次に、この2者複合体にIL-18βを滴定した。以上の実験から、IL-18上のIL-18α及びIL-18βとの相互作用面を同定した。2者複合体の分子量は6万、3者では10万となるが、TROSY法を利用することにより高感度に測定を行うことができた。以上の相互作用データから、IL-18とIL-18受容体の相互作用モードは、IL-1と受容体のそれと極めて類似していることが明らかになった。
IL-18-IL-18Rα-IL-18Rβ三者複合体の結晶構造解析
さらに詳細な分子認識機構の解明のため、上記三者複合体の結晶化を進め、結晶を得ることができた。回折データを取得したが、IL-1複合体を用いた分子置換法では構造決定に至らなかった。そこで、MAD法を行うべく、IL-18のセレノメチオニン標識体を作成し、結晶化を進めている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

TIRドメインの複合体の構造解析は、当初予定よりも遅れているが、IL-18関連の研究が、当初計画以上に進んでいるため。

今後の研究の推進方策

TIRドメイン複合体の構造解析に注力する。基本的に、TIR間の相互作用は、それほど強くなく、ヘテロ二量体の形成は、細胞外ドメインが二量体を形成することにより誘起される。そこで、強制的にTIRヘテロ二量体を組ませるようなコンストラクトを作成し、NMRを用いて相互作用を確認し、結晶化に進む。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2012 2011

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 1件) 学会発表 (3件)

  • [雑誌論文] NMR analysis of Lys63-linked polyubiquitin recognition by the tandem ubiquitin-interacting motifs of Rap802012

    • 著者名/発表者名
      Sekiyama, N., Jee, J., Isogai, S., Akagi, K., Huang, T. H., Ariyoshi, M., Tochio, H., Shirakawa, M
    • 雑誌名

      J Biomol N

      巻: 52 ページ: 339-350

    • DOI

      doi:10.1007/s10858-012-9614-9

  • [雑誌論文] Substrate/Product-targeted NMR monitoring of pyrimidine catabolism and its inhibition by a clinical drug2012

    • 著者名/発表者名
      Yamada H, Mizusawa K, Igarashi R, Tochio H, Shirakawa M, Tabata Y, Kimura Y, Kondo T, Aoyama Y
    • 雑誌名

      ACS Chemical Biology

      巻: 7 ページ: 535-542

    • DOI

      10.1021/cb2003972

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Crystal structure of the ubiquitin-associated (UBA) domain of p62 and its interaction with ubiquitin2011

    • 著者名/発表者名
      Isogai S., Morimoto D., Arita K., Unzai S., Tenno T., Hasegawa J., Sou YS., Komatsu M., Tanaka K., Shirakawa M., Tochio H.
    • 雑誌名

      Journal of Biological Chemistry

      巻: 286 ページ: 31864-31874

    • DOI

      doi:10.1074/jbc.M111.259630

  • [学会発表] Structural basis for receptor recognition of interleukin 182011

    • 著者名/発表者名
      堤尚孝、木村豪、大西秀典、加藤善一郎、近藤直実、杤尾豪人、白川昌宏
    • 学会等名
      第34回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      横浜
    • 年月日
      20111213-20111216
  • [学会発表] Analysis of proteins inside human cultured cells by NMR2011

    • 著者名/発表者名
      Hidehito Tochio
    • 学会等名
      The 4th Asia Pacific NMR symposium
    • 発表場所
      Beijing, China
    • 年月日
      20111016-20111018
  • [学会発表] Magnetic resonance methods for analyses of structure and dynamics of intracelluar proteins and cells2011

    • 著者名/発表者名
      杤尾豪人
    • 学会等名
      第49回日本生物物理学会年会
    • 発表場所
      姫路
    • 年月日
      20110916-20110918

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公開日: 2013-06-26  

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