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篩管を介して接ぎ木相手にsmall RNAを送り込むことで、接ぎ木相手の一部の組織における相補なDNA配列にメチル化を介してジーンサイレンシングを発動させることができる事実がタバコとトマトとの間で証明できた。
そこで、このシステムをリンゴで行うための技法を検討した。先ず、siRNAを産生できる導入用コンストラクトを構築した。リンゴのターゲット遺伝子としてポリガルクツロナーゼMdPG1を選んだ。この遺伝子産物は果実の後熟過程で特異的に発現し、細胞壁を分解・果肉を軟化させる酵素である。このプロモーター配列約1 kbを得て、これの逆位反復配列を構成することで2本鎖RNAを経てsiRNAを産生させることができた。
このコンストラクトをリンゴ栽培種に接ぎ木可能な野生種Malus sieversiiの子葉からの培養組織に導入した。また、この野生種と栽培リンゴ王林との接ぎ木を継代培養シュート間で成立させる技術を確立した。siRNAを接ぎ木相手に輸送させるのは穂木から台木方向が大きいこと、さらに側根にはサイレンシングが全域に起こる事実から、培養体の根からの再分化体を獲得することで、サイレンシング個体が獲得される。そこで根生不定芽を得るためにフェノール系化合物のフロログルシノールを含む培地上に根を置床することで、再分化体が獲得できることに成功した。一方、リンゴの場合、継代培養シュートの基部よりカルスを経て不定芽が形成されることから、siRNA産生個体を穂木、王林を台木として接ぎ木し、そのシュートの基部より新生シュートを得ることで、直接エピゲノミックの変化による枝変わりが獲得される系が考案された。
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