| 研究概要 |
本研究は,ナノモル濃度のリン酸化分子を選択的に捕捉できる蛍光発色団を有するオリジナルな分子(蛍光性フォスタグ)を用いた新しいリン酸化プロテオーム解析法の開発を目的としている。蛍光性フォスタグを用いた本手法は,従来のリン酸化分子の分析法(放射性同位体法,抗リン酸化抗体法,単核金属錯体法)と比較して,より網羅的かつ迅速なリン酸化反応解析を可能にし,簡便な操作性や安全性などの利点をもち,癌やアルツハイマーなど生体内リン酸化反応のバランス異常に起因する病態の治療薬や診断法の開発に役立つ革新的な分析技術である。本年度は,可視光領域に蛍光を発生するフォスタグとリン酸化基質ペプチド組み合わせたキナーゼ反応の検出法を開発した。さらに,磁気ビーズにフォスタグ分子結合させた新しい機能性分子を作成し,蛍光発色基をもつキナーゼ基質ペプチドを効率よく分離して定量する新しい手法を検討した。本磁気ビーズ法の開発では,水溶性スペーサーを結合した新規フォスタグの合成とその物性の検討を行った。その後,フルオレセイン蛍光色素を結合させたリン酸化基質とフォスタグとの結合および解離反応速度論を時間分解蛍光分析法で解析した。その結果,μmol濃度の稀薄な条件下においても,フォスタグ分子(磁気ビーズ結合型フォスタグや蛍光性フォスタグ)は数秒以内にリン酸化ペプチド基質を捕捉すること,さらに,リン酸緩衝液を用いた生理条件下で,数分以内にほぼ100%の基質を解離することも明らとなった。このフォスタグ分子の速度論的な特徴は,リン酸化ペプチド基質のリアルタイム検出に十分応用可能なものであり,今後様々なキナーゼ反応解析の実施例を作成していきたいと考えている。
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