中性子回折による創薬標的タンパク質のリガント認識機構の解明

2010 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 22390010
• 研究機関: 独立行政法人日本原子力研究開発機構
• 研究代表者: 黒木 良太 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 量子ビーム応用研究部門, 研究主席 (30391246)
• 研究分担者: 城所 俊一 長岡技術科学大学, 工学部, 教授 (80195320) ; 玉田 太郎 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 量子ビーム応用研究部門, 研究主幹 (50391248) ; 安達 基泰 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 量子ビーム応用研究部門, 研究副主幹 (60293958) ; 大原 高志 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 量子ビーム応用研究部門, 研究副主幹 (60391249) ; 栗原 和男 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 量子ビーム応用研究部門, 研究副主幹 (50354890)
• キーワード: 蛋白質 / 分子認識 / 水和 / 分子設計

研究概要

平成22年度は、下記の2つの課題を重点的に実施した。
1.水素原子位置の決定を目的とした解析用タンパク質試料作製
i)ガン治療標的となるSer/Thrキナーゼ、ii)強毒性インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ、およびiii)薬剤耐性ヒト免疫不全ウイルス由来のプロテアーゼなどの創薬標的タンパク質の発現系構築および精製を試みた。キナーゼおよび薬剤耐性ウイルス由来プロテアーゼ試料は、大腸菌発現によって作製に成功し、さらにX線回折法による結晶構造解析を実施した。強毒性インフルエンザウイルス由来ノイラミニダーゼは、大腸菌およびブレビバチルス発現系を用いて発現を試みたが目的タンパク質を得ることはできなかった。そこで新たにβラクタマーゼを試料として作製し、X線による結晶構造解析を実施した。その結果、中性子解析に適した格子長を有する3種類のタンパク質結晶の取得に成功した。
2.大型結晶作製に向けての準備(タンパク質物性の改良)
中性子構造解析用の大型結晶試料の作製において、タンパク質分子の溶解度や分子の均一性の向上を目的として物性の改変を試みた。上記の課題のタンパク質について、分子内に存在する遊離型Cys残基を系統的に除去することにより、非特異的なジスルフィド形成の抑制に成功した。また化学的に弱いアミノ酸配列(Asn-Gly)におけるAsnを、Glnへ置換することによって、脱アミド化に伴うイソアスパラギン酸生成を抑制し、良質な大型結晶を得ることができた。

研究成果

• [雑誌論文] 中性子と放射光の相補的な利用による創薬標的タンパク質の立体構造解析 (2010)
  • 著者名/発表者名: 黒木良太, 他4名
  • 雑誌名: 薬学雑誌 巻: 130 ページ: 957-964
  • 査読あり
• [雑誌論文] Towards investigation of the inhibitor-recognition mechanisms of drug-target proteins by neutron crystallography (2010)
  • 著者名/発表者名: R.Kuroki, et al
  • 雑誌名: Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 巻: 66 ページ: 1126-1130
  • 査読あり
• [雑誌論文] X-ray and neutron protein crystallographic analysis of the trypsin-BPTI complex (2010)
  • 著者名/発表者名: K.Kawamura., et al.
  • 雑誌名: Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr. 巻: 67 ページ: 140-148
  • 査読あり
• [学会発表] 生体高分子専用高分解能中性子結晶回折計I)装置のコンセプト～装置を使った研究の展開 (2010)
  • 著者名/発表者名: 黒木良太
  • 学会等名: 日本中性子科学会・サテライトシンポジウム
  • 発表場所: 東北大学多元物質科学研究所
  • 年月日: 2010-12-11
• [学会発表] 原子力機構におけるタンパク質中性子構造解析の現状 (2010)
  • 著者名/発表者名: 玉田太郎, 他
  • 学会等名: 日本結晶学会
  • 発表場所: 大阪大学コンベンションセンター
  • 年月日: 2010-12-05
• [学会発表] 変異導入と結晶構造解析によるナガガジ由来不凍タンパク質の抗凍結機構の解析 (2010)
  • 著者名/発表者名: 大原高志, 他
  • 学会等名: 日本結晶学会
  • 発表場所: 大阪大学コンベンションセンター
  • 年月日: 2010-12-05
• [学会発表] 高効率なトレハロース合成をつかさどる古細菌由来の2つの酵素の立体構造解析 (2010)
  • 著者名/発表者名: 岡崎伸生, 他
  • 学会等名: 日本結晶学会
  • 発表場所: 大阪大学コンベンションセンター
  • 年月日: 2010-12-05
• [学会発表] 中性子結晶構造解析を目指したフェレドキシン依存性還元酵素PcyAの結晶成長 (2010)
  • 著者名/発表者名: 石川久美子, 他
  • 学会等名: 日本結晶学会
  • 発表場所: 大阪大学コンベンションセンター
  • 年月日: 2010-12-05
• [学会発表] 中性子線構造解析に向けたタンパク質大型結晶の高効率育成新技術の開発 (2010)
  • 著者名/発表者名: 垣之内啓介, 他
  • 学会等名: 日本結晶学会
  • 発表場所: 大阪大学コンベンションセンター
  • 年月日: 2010-12-03
• [学会発表] 中性子構造解析を目指したヒトMAPキナーゼJNK1変異導入による結晶パッキングの改変 (2010)
  • 著者名/発表者名: 仲庭哲津子, 他
  • 学会等名: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター
  • 年月日: 2010-06-16
• [学会発表] 薬剤耐性A17型HIV-1プロテアーゼと阻害剤複合体のX線結晶構造解析 (2010)
  • 著者名/発表者名: 安達基泰, 他
  • 学会等名: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター
  • 年月日: 2010-06-16
• [学会発表] 研究用原子炉JRR-3におけるタンパク質結晶中性子回折実験 (2010)
  • 著者名/発表者名: 栗原和男, 他
  • 学会等名: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • 発表場所: 札幌コンベンションセンター
  • 年月日: 2010-06-16
• [産業財産権] 生産性および不凍活性を向上させた改変型不凍タンパク質とその製造方法 (2010)
  • 発明者名: 黒木良太, 他5名
  • 権利者名: 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 他名
  • 産業財産権番号: 特許、特願2010-105583
  • 出願年月日: 2010-04-30