| 研究課題/領域番号 |
22390150
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| 研究機関 | 山口大学 |
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研究代表者 |
寺井 崇二 山口大学, 大学院・医学系研究科, 准教授 (00332809)
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| 研究分担者 |
坂井田 功 山口大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (80263763)
内田 耕一 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (80397992)
山本 直樹 山口大学, 大学教育機構, 講師 (90448283)
高見 太郎 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (60511251)
石川 剛 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (20569305)
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| キーワード | 骨髄細胞 / 修復再生療法 / 肝線維化 / 肝再生 / ABMi療法 / 遺伝子治療 |
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| 研究概要 |
GFP陽性骨髄由来Liver Repair cellの培養方法の確立と解析
Lonza社より購入したヒト骨髄単核球細胞(2M-125A)の効率的な培養方法を検討した。ウシ血清含有培地による通常培養と、無血清培地培養法を比較検討した。その結果、マウス培養結果とは異なり、少なくともヒト骨髄由来細胞の培養初期(培養皿への細胞接着)には血清が必要であることが明らかとなった。
骨髄由来培養Liver Repair cellと肝臓構成細胞との相互作用の検討(in vitro実験)
ウシ血清含有培地で3継代培養したヒト骨髄由来細胞は、FACS解析で「CD73/CD90/CD105陽性かつCD45/CD11b陰性細胞(間葉系マーカー陽性かつ血球性マーカー陰性細胞)」であることを確認した。
骨髄由来培養Liver Repair cell投与実験
四塩化炭素腹腔内反復投与により作成したマウス免疫不全肝硬変モデル(SCID-CCl4モデル)に、Lonzaヒト骨髄単核球細胞をウシ血清含有培地で培養した「ヒト骨髄由来細胞(CD73/CD90/CD105陽性かつCD45/CD11b陰性細胞)」を4.5x105個/匹で尾静脈投与し、その後の肝線維化の改善をシリウスレッド染色により評価した。その結果、細胞投与4週後において肝線維化は有意に抑制され、血清アルブミン値も投与後4週において有意に上昇し、肝線維溶解部に一致してMMP-9陽性細胞と間葉系マーカーであるVimentin陽性細胞の増加を確認した。以上より、ヒト骨髄由来間葉系細胞が「ヒト骨髄LR細胞」であることが強く示唆された。
TNF-R1 KOマウス、Maid KOマウスをレシピエントマウスにした場合の骨髄細胞定着率、肝機能・線維化改善の検討
TNF-R1 KOマウスをレシピエントにした場合で評価した。CCl4を従来の方法と同じように4週間TNF-R1 KO、Maid KOマウスに投与し、これらにGFP陽性骨髄細胞を投与する。その後1,2,3,4週目に肝臓組織を摘出し、GFP抗体による免疫染色・蛍光二重染色で骨髄細胞の定着率を評価した。Azan染色、Sirius-red染色で肝線維化の改善が確認できた。
Hydrodynamic Tail Vein injection(HTVi)法を用いた遺伝子導入法による肝臓修復メカニズムの解析
野生型マウスに四塩化炭素を腹腔内へ反復投与し肝硬変モデルの肝臓にHTVi法を用いてMaidを強制発現させるためのベクターを作成した。今後従来法(GFP陽性骨髄細胞投与)による肝機能・線維化改善効果とも比較する。
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