微小血管網を有するヒト型高次肝組織構築過程のライブ観察

2011 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 22390260
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 小池 直人 横浜市立大学, 医学研究科, 客員研究員 (50301081)
• 研究分担者: 谷口 英樹 横浜市立大学, 医学研究科, 教授 (70292555)
• キーワード: 血管 / 肝臓 / 組織再構築 / 再生医学

研究概要

クラニアルウインドウ法を用いて血管網を有するヒト型高次肝組織を生体内において再構築し、組織再構築過程における細胞間相互作用や血流因子の解析をライブ観察にて行った。Collagen-Gelに、Kusabira Orangeを導入したヒト血管内皮細胞(KO-HUVEC)・ヒト骨髄由来間葉系幹細胞(hMSC)とEGFPを導入したヒト胎児肝細胞(EGFP-hFLC)を共培養し、このhFLCコラーゲンゲルをクラニアルウインドウ内に移植し、生体蛍光顕微鏡で経時的に観察した。その結果、EGFP-hFLCは急速に増殖し、互いに接着し、7日目までに1個1個の細胞を識別できなくなった。同時にHUVECは血管網をこの中で形成し、ローダミンデキストランをトレーサーとして静注すると、10日目にはHUVECからなる微小血管網に宿主よりの血流が観察できた(機能血管)。移植後30日目にhFLC内の機能血管の定量を行い、前年確立したHUVEC-hMSCのみから形成された機能血管と比較した。その結果、hFLC内の機能血管の方が密度は高かったが、平均血管径は12μm程度で両者に差はなかった。この時点でELISA法にてマウス血液内にヒトアルブミンが確認され、構築されたヒト型肝組織がアルブミン産生能を有していることが確認できた。40日目のhFLCコラーゲンゲル内の機能血管を共焦点顕微鏡で観察したところ、その血管径は3-4μmでマウス類道血管径とほぼ同じで、形態も似ていることが確認された。移植後30日目でコラーゲンゲルを摘出し、whole mount免疫染色を行ったところ、成熟肝組織に認められる接着分子ZO-1、Eカドヘリン、基底膜の構成因子4型コラーゲンやラミニンが確認できた。パラフィン切片の免疫染色ではアルブミン以外に肝組織のマーカーhepatocyte specific antigenが認められ、電顕の観察でもヒト成熟肝組織の構造を有していることが確認できた。今後このモデルは微小血管網を伴った高次機能を発揮可能な移植用組織の開発や、創薬開発のプラットホームにできる可能性がある。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

肝組織構築における微小血管網の定量化はhFLC,HUVEC,hMSC共培養の系のみでしか行なっていない。それは、hFLC単独培養ではhFLCに含まれる内皮細胞を別標識することが困難だった為である。そのかわり、HUVEC,hMSCの系と比較し、hFLC,HUVEC,hMSCの系の方で血管密度が高くなる結果を得た。このことは、hFLC内には内皮細胞の基となる細胞成分が元々含まれている手がかりとなると思われた。

今後の研究の推進方策

hFLCは肝細胞のみでなく3肝組織の構築に必要な血管内皮細胞、間葉系細胞が含まれていると推測していたが、上記結果はそれを示唆するものと考えられた。肝組織構築における血管内皮細胞や間葉系細胞の意義を評価するためには、hFLCから適切なマーカーを用いて内皮細胞、間葉系細胞をFACSで分離する必要が有る。しかし、このマーカーの選択と、FACSによる細胞のダメージをどう克服するかが重要な課題となっている。また、現在、コラーゲンゲル内の肝組織の構造は均一ではなく、肝組織とかけ離れた構造を呈する部分も認められる。組織構築を均一なものにする技術も検討する余地がある。

研究成果

• [雑誌論文] Gd-EOB-DTPA-Enhanced MRI versus Extracellular Contrast Medium-Enhanced MRI in Differentiation of Metastatic from Benign Liver Lesions (2012)
  • 著者名/発表者名: Koike N, Onaya H
  • 雑誌名: Ann Gastroenterol Hepatol 巻: 3 ページ: 57-62
  • URL: http://www.agh.sanlucasmedical.com/Issue/1-2012
  • 査読あり
• [雑誌論文] 肝幹細胞研究の最新動向 (2012)
  • 著者名/発表者名: 谷口英樹, 内藤貴子, 上野康晴
  • 雑誌名: G.I.Research 巻: 20 ページ: 30-36
• [雑誌論文] Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor (2011)
  • 著者名/発表者名: Ishikawa M, Sekine K, Okamura A, Zheng YW, Ueno Y, Koike N, Tanaka J, Taniguchi H
  • 雑誌名: J Biosci Bioeng 巻: 111 ページ: 711-718
  • DOI: DOI:10.1016/j.jbiosc.2011.01.019
  • 査読あり
• [雑誌論文] 胆嚢炎と十二指腸狭窄を合併したsegmental arterial mediolysisの1例 (2011)
  • 著者名/発表者名: 木原一樹、小池直人、大島祐二、武内俊章、有田誠司、渡橋和政
  • 雑誌名: 日本臨床外科学会雑誌 巻: 72 ページ: 711-718
  • 査読あり
• [雑誌論文] 双孔式人工肛門脱を自動縫合器による局所治療にて修復した1例 (2011)
  • 著者名/発表者名: 大島祐二、小池直人、武内俊章、有田誠司、大河内信弘
  • 雑誌名: 手術 巻: 65 ページ: 655-657
  • 査読あり
• [雑誌論文] Reconstruction of human elastic cartilage by a CD44+CD90+ stem cell in the ear perichondrium (2011)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi S, Takebe T, Inui M, Iwai S, Kan H, Zheng YW, Maegawa J, Taniguchi H
  • 雑誌名: Proc Natl A cad Sci USA 巻: 108 ページ: 1479-1484
  • DOI: 10.1073/pnas.1109767108
  • 査読あり
• [雑誌論文] フローサイトメトリーを用いた膵幹/前駆細胞の特性解析 (2011)
  • 著者名/発表者名: 谷口英樹
  • 雑誌名: 胆と膵 巻: 32 ページ: 1207-1212
• [雑誌論文] 固形腫瘍幹細胞膵がんにおけるがん幹細胞の特性解析 (2011)
  • 著者名/発表者名: 谷口英樹, 小池博之
  • 雑誌名: 実験医学 巻: 29 ページ: 3254-3261
• [学会発表] In vitroでの自己組織化肝オルガノイド形成 (2011)
  • 著者名/発表者名: 武部貴則, 関根圭輔, 江野村允宏, 上野康晴, 鄭允文, 谷口英樹
  • 学会等名: 第47回日本移植学会
  • 発表場所: 仙台国際センター宮城県
  • 年月日: 2011-10-05
• [学会発表] 消化管における幹細胞研究の現状と展望 (2011)
  • 著者名/発表者名: 谷口英樹
  • 学会等名: 第47回日本移植学会
  • 発表場所: 仙台国際センター宮城県(招待講演)
  • 年月日: 2011-10-05
• [学会発表] Evaluation of drainage fluid amylase level after pancreatojejunostomy using our method inpancreatoduodenectomy (2011)
  • 著者名/発表者名: Koike N, Ohshima Y, Arita S、Takeuchi T, Ohkohchi N
  • 学会等名: International Surgical Week 2011
  • 発表場所: パシフィコ横浜神奈川県
  • 年月日: 2011-08-31
• [学会発表] 当科での膵空腸吻合法と術後排液量、排液アミラーゼ値の検討 (2011)
  • 著者名/発表者名: 小池直人、大島祐二、武内俊章、大河内信弘
  • 学会等名: 第66回日本消化器外科学会総会
  • 発表場所: 名古屋国際会議場愛知県
  • 年月日: 2011-07-13
• [学会発表] 十二指腸乳頭部癌に対する弾頭兼十二指腸第II部切除術 (2011)
  • 著者名/発表者名: 小池直人、大島祐二、大河内信弘
  • 学会等名: 第23回日本肝胆膵外科学会・学術集会
  • 発表場所: 京王プラザホテル東京
  • 年月日: 2011-06-09