| 研究概要 |
低酸素環境下で、幹細胞やES細胞はHIF (hypoxia inducible factor)の働きにより未分化状態が維持されていることが報告されており、iPS細胞でもHIFの働きによることが推察される。本研究では低酸素環境下でのHIFの働きについて検討した。
実験には理研CELLBANKより購入したマウスiPS細胞(iPS-MEF-Ng-178B-5)を用いた。MEFを播種したDish上に、マウスiPS細胞を5日間FBS、2-Mercaptoethanol、NEAA、mouseLIF、penicillin/streptomycin、bFGF添加DMEMで培養。継代時にsiRNAをトランスフェクションした3因子導入マウスiPS細胞を60mmDish上に1.0×10^5 cell/cm^2の密度で播重し、5%O_2下で48時間培養した。それぞれのDishには50nM siRNAs {Product Names : Mm_Hifla_4FlexiTube siRNA, Mm_Epas1 (Hif2a)_5FlexiTube siRNA, Mm_Hif3a_5FlexiTube siRNA, QIAGEN}にHiPerfect transfection reagent (QIAGEN)を添加しており、siRNA導入48時間後に細胞を回収し、細胞形態、Nanog,Sox2,Oct4のmRNA発現量を比較した。対照群は、AllStars Negative Controls (QIAGEN)をトランスフェクションしたものを用いた。
siRNAを導入し、HIFsをノックダウンしたときのiPS細胞のコロニーの形態学的観察を行った。HIF1aをノックダウンしたもののでは、対照群と同様にiPS細胞のコロニーを形成した。しかし、HIF2aをノックダウンしたものでは、コロニーは形成するもののコロニーサイズが減少していた。HIF3aをノックダウンしたものでは、HIF1aをノックダウンしたときと同様に、対照群と同じようにiPS細胞のコロニーを形成した。
HIF1aをノックダウンしたものでは、未分化マーカーであるNanog,Sox2,Oct4の発現量は対照群と有意差はなかった。HIF2aをノックダウンしたものでは、対照群と比較して、Nanog、Sox2、Oct4の発現量は有意に減少していた。また、HIF3aをノックダウンしたものも、対照群と比較して、Nanog、Sox2、Oct4の発現量は有意に減少してした。
|
