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本年度は，昨年度確立した生体材料内における氷結晶計測法により，耐凍剤を浸透させた生体細胞内の氷結晶を計測し，耐凍剤の効果を評価した．耐凍剤にはエチレングリーコル（EG）を選び，EG水溶液は0wt.％（未処理）10 wt.％，20 wt.％，30 wt.％，40 wt.％50 wt.％とした．供試材料として生牛肉の筋繊維を選び，EG水溶液に120min浸した．試料は，ドライアイス（－78℃）上部と液体窒素（－196℃）上面の銅版により60min凍結した．試料の分光画像は，極低温マイクロスライサスペクトルイメージングシステムにより撮影（1500 nm）した．得られた分光画像から氷結晶の面積，長軸，短軸，長短軸比を計測し，相当円直径を算出した．ドライアイスにより凍結した0wt.％の氷結晶の相当円直径は，最小24.8μm，最大139.1μm，平均45.2で，50wt.％は最小18.1μm，最大71.1μm，平均36.8であった． 液体窒素により凍結した0wt.％の氷結晶の相当円直径は，最小20.6μm，最大158.3μm，平均47.7で，50wt.％は最小12.9μm，最大79.6μm，平均25.8であった．両者の相当円直径は，EG0wt.％からEG30wt.％までは，EG濃度の増加ともに相当円直径が小さく算出されたが，EG30wt.％からEG50wt.％の間では大きな変化が見られなかった．これは，凍結方法が異なっても，生体細胞に耐凍剤としてEGを使う場合，EG30wt.％程度が目安になることを示唆している．また，液体窒素による凍結で生成された氷結晶が小さいことが分かった．本手法は，「耐凍剤」「氷結晶」「細胞破壊」などの相互関係による生殖組織の最適凍結保存法を解明するツールとして応用されると考えられる．
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