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加熱食品中に含まれる発がん物質ヘテロサイクリックアミン類の中で最も多く存在するPhIPは、ゲノムDNA中のdGと付加体を形成する。この付加体ががん抑制遺伝子・がん遺伝子中にできて変異を引き起こすことが発がんの一因と考えられるが、この遺伝子変異だけではPhIPの発がん性のすべてを説明することは出来ない。PhIP-DNA付加体形成によりDNA損傷チェックポイント応答(DDR)が活性化し、その状況が解消されずに持続すること、或いはDDRが破綻することが、発がんの前段階として極めて重要と考えられる。細胞株・初代培養細胞・ラット個体などを用いて、これを実証することが本研究の目的である。今年度は、ヒト培養細胞株を用いて、PhIP暴露によるDDR活性化を調べ、どの経路が活性化しているのかを解析した。
具体的にはHCT116及びCCL75細胞をPhIP+S9 mix(PhIPの代謝活性化酵素を含む)で一定時間処理した後、洗浄・培養して経時的に細胞を回収し、DDRやDNA2重鎖切断等の損傷を調べた。PhIP曝露によるATM/ATR、Chk1/Chk2、p53、H2AX等のDDR関連因子の活性化(リン酸化)が認められた。Replication Stress(複製フォーク停止)の指標であるPCNAのモノユビキチン化やRPAのリン酸化も確認された。DNA2重鎖切断の指標となるγH2AXの免疫染色を行い、PhIPを抜いてからの時間経過(修復過程)を調べると、30時間後までに大部分の損傷は修復されたが、一部のγH2AXフォーサイはそのまま残存し、継代を繰り返しても保持され続けた。
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